王海燕，梁利香

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛Radix Ranunculi Ternati.的干燥塊根，收載于《中國(guó)藥典》2015年版(一部)。貓爪草原為無(wú)名野草，藥用歷史較短，是上世紀(jì)50年代于河南省信陽(yáng)地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種草藥，后經(jīng)信陽(yáng)中醫(yī)院依據(jù)其根形及能治療鼠瘡的特點(diǎn)定名為“貓爪草”。對(duì)其藥理歷代本草均無(wú)記載，民間主要用于治療頸淋巴結(jié)核(俗稱老鼠瘡)、腮腺炎(俗稱痄腮)。文字記載則首見(jiàn)于《中藥材手冊(cè)》，1977年《中華人民共和國(guó)藥典》開始收載，《中國(guó)藥用植物志》《廣西中藥志》《河南中草藥手冊(cè)》《湖北植物志》等也有記載。貓爪草主產(chǎn)于河南信陽(yáng)地區(qū)的淮濱、息縣及駐馬店地區(qū)的正陽(yáng)、確山；另外，我國(guó)長(zhǎng)江中、下游 (包括浙江、江蘇、安徽、江西、廣西、河南、湖北、湖南、四川、云南、貴州等省) 以及臺(tái)灣地區(qū)均有分布， 在日本本州、四國(guó)、九州也有分布[1-2]。功能化痰散結(jié)，解毒消腫，用于瘰疬痰核，疔瘡腫毒，蛇蟲咬傷[3]。貓爪草是河南省的一大宗藥材，同時(shí)被列為國(guó)家藥品監(jiān)督管理局重點(diǎn)發(fā)展的63種緊缺中藥材之一，是國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展的三類中藥材之一?，F(xiàn)在臨床用于治療淋巴結(jié)結(jié)核、淋巴結(jié)炎、肺結(jié)核、咽炎、淋巴瘤、甲狀腺瘤、乳腺腫瘤、肺癌等疾病[4-5]。貓爪草近年來(lái)由于其抗腫瘤活性備受人們的關(guān)注，諸多實(shí)驗(yàn)研究表明貓爪草多糖(PRT)是其抗腫瘤、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)免疫的活性成分[6-11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同產(chǎn)地貓爪草中粗多糖和多糖的含量進(jìn)行對(duì)比研究，為河南產(chǎn)貓爪草的道地性、資源開發(fā)和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料與試劑

貓爪草分別產(chǎn)自河南信陽(yáng)地區(qū)的淮濱和息縣、河南駐馬店地區(qū)的正陽(yáng)和確山、湖北、江蘇、安徽、浙江、江西、廣西、湖南、四川、云南、貴州等地，由信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院中藥教研室鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，藥材來(lái)源見(jiàn)表1。無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，批號(hào)為GBW1006213001,含量為99%)；酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、無(wú)水硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇等均為分析純，純化水自制。

1.2 儀器

751G型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；水循環(huán)恒溫水浴箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；AB-135-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器制造有限公司)；SCQ-8201E超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

表1 藥材來(lái)源

1.3 藥材處理

將貓爪草挑練、淘洗后，105℃烘干，粉碎成60目，備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 DNS試劑配制

稱取酒石酸鉀鈉18.2g，溶于50ml蒸餾水中，加熱(50℃以下)，于熱溶液中依次加入2.1g氫氧化鈉、0.63g 3,5-二硝基水楊酸、苯酚0.5g和無(wú)水亞硫酸鈉0.5g，超聲(45～50℃)至溶，冷卻后用蒸餾水定容至100ml，棕色瓶?jī)?chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱定105℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品59.1mg于50ml容量瓶中，加純化水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取上述葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.5、0.7、0.8、1.0 mL于6只25 mL容量瓶中，加水至1mL，加DNS試劑3mL，沸水浴加熱15min，迅速冷卻至室溫，加水稀釋至刻度。按照紫外-可見(jiàn)分光光度法[12]，在550nm處測(cè)定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=0.013385C-0.03355(r=0.9992)，結(jié)果表明葡萄糖在9.456～47.28μg/mL范圍內(nèi)線性良好。結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收度測(cè)定結(jié)果

2.3 貓爪草中粗多糖和多糖的含量測(cè)定

2.3.1粗多糖的制備及收率測(cè)定 取各產(chǎn)地貓爪草藥材粉末(60目)各3份，每份100g，加藥材量0.2%的α-淀粉酶和3倍量水進(jìn)行酶解，酶解溫度 50℃，酶解pH值為 6 ，酶解時(shí)間30min；再加7倍量水超聲提取20min，超聲功率為300W；抽濾，濾渣再加水超聲提取2次，每次加水10倍量，提取20min，合并3次α-淀粉酶協(xié)同超聲提取法提取所得水提液，濃縮至約100mL(每mL藥液相當(dāng)于1g藥材)，冷卻至室溫，加乙醇至乙醇含量70%，置冰箱中冷藏過(guò)夜，抽濾，60℃干燥，即得。稱量、計(jì)算粗多糖收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.2 多糖溶液的制備及測(cè)定 稱取貓爪草粗多糖約30mg，置25ml容量瓶中，加水5mL，加6mol/L鹽酸6mL，超聲溶解，置90℃烘箱中，加熱30min，取出冷卻至室溫，加6mol/L氫氧化鈉溶液至溶液呈中性，加水至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液2 mL置25 mL容量瓶中，加DNS試劑3mL，沸水浴加熱15min，迅速冷卻至室溫，加水稀釋至刻度，550nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算粗多糖中多糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。用Excel中單因素方差分析對(duì)14個(gè)產(chǎn)地和河南省4個(gè)產(chǎn)地貓爪草中粗多糖含量(%)和多糖含量(%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)不同產(chǎn)地粗多糖和多糖含量的相關(guān)性進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4-8。

表3 不同產(chǎn)地貓爪草中粗多糖和多糖含量(n=3)

表4 14個(gè)產(chǎn)地粗多糖含量的顯著性差異方差分析表

表5 14個(gè)產(chǎn)地多糖含量的顯著性差異方差分析表

表6 4個(gè)產(chǎn)地粗多糖含量的顯著性差異方差分析表

表7 4個(gè)產(chǎn)地多糖含量的顯著性差異方差分析表

表8 粗多糖和多糖含量相關(guān)性檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地貓爪草中粗多糖和多糖的含量有極顯著差異。14個(gè)產(chǎn)地粗多糖含量(%)F值為135.3905(p《0.01)，多糖含量(%)F值為151.7603(p《0.01),以河南信陽(yáng)淮濱產(chǎn)貓爪草中總糖和多糖的含量最高；但河南四個(gè)產(chǎn)地(1-4號(hào))產(chǎn)的貓爪草中粗多糖和多糖的含量無(wú)明顯差異，粗多糖含量F值為3.628(p=0.06>0.05)，多糖含量F值為2.63(p=0.122>0.05)。即本試驗(yàn)結(jié)果表明：在被考察產(chǎn)地中以河南信陽(yáng)貓爪草中粗多糖和多糖含量最高，且與其它產(chǎn)地有顯著性差異，貓爪草中粗多糖和多糖含量具有顯著相關(guān)性。貓爪草的采收季節(jié)為春季和秋季，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明不同產(chǎn)地貓爪草中粗多糖和多糖的含量差異明顯，原因或許是地域差異也或許是季節(jié)差異所致或與地域、采收季節(jié)均有關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

多糖的測(cè)定方法有多種，目前國(guó)內(nèi)測(cè)定中藥材中多糖含量的方法以比色法為主，包括咔唑一硫酸、蒽酮一硫酸 、苯酚-硫酸、3 ，5-二硝基水楊酸、鄰甲苯胺法等。較常用的是苯酚-硫酸法和蒽酮一硫酸法，其原理均是己糖在硫酸作用下，分子內(nèi)脫水生成糠醛可與之縮合成有色配合物，可在可見(jiàn)波長(zhǎng)區(qū)有最大吸收。但因苯酚-硫酸法中所用苯酚試劑需蒸餾后方可使用，且污染較大；蒽酮-硫酸法，操作繁瑣，顯色時(shí)間、溫度、操作的快慢等都會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果有不同程度的影響。本實(shí)驗(yàn)采用水解后以DNS試劑顯色，實(shí)驗(yàn)表明線性良好，顯色穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)單，適用于貓爪草中多糖的比色測(cè)定。