張真真，戴姝艷

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子宮內(nèi)膜異位癥 （endometriosis，EMs） 是育齡期婦女的常見疾病，指子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在宮腔以外的身體其他組織而引起的一種疾病，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，可達(dá)10%～15%。EMs所引起的痛經(jīng)、下腹痛和性交痛等，嚴(yán)重影響婦女的健康和生活質(zhì)量［1］，EMs雖為良性病變，但具有類似惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和種植侵襲能力［2-3］，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來對EMs發(fā)病機(jī)制的研究［4］表明，異位病灶的發(fā)生與發(fā)展必須有新生血管的建立才能得以維持。血管緊張素被證實(shí)是促進(jìn)生理性及病理性血管生成的重要因子，主要通過與AT1、 AT2結(jié)合，發(fā)揮生理作用。研究［5-6］發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)血管緊張素Ⅱ2型受體 （angiotensinⅡtype 2 receptor，AT2R） 對高血壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展有抑制作用，提示AT2R可能在疾病病程中發(fā)揮保護(hù)性作用，但目前AT2R在EMs中的作用未見報(bào)道。本研究通過分析AT2R對大鼠子宮內(nèi)膜異位結(jié)節(jié)血管形成的影響，來探討AT2R在EMs發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級雌性、清潔、性成熟、未孕SD大鼠45只，體質(zhì)量 （180±20） g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號(hào)：SCXK （京） 2014-0004，倫理編號(hào)：2016PS320K，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院本溪實(shí)驗(yàn)基地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20%～25%，濕度50%～70%，照明周期為12/12 h，自由食水，保持墊料干燥，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

CGP42112A購自美國Sigma公司；氯沙坦購自大連美侖生物技術(shù)公司；大鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） ELISA 試劑盒、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor α，TNF-α） ELISA試劑盒、微血管染色所用的兔抗鼠CD34多克隆抗體均購自武漢博士德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 大鼠EMs模型的建立：Vernon自體移植法［7］建立大鼠EMs模型，4周后開腹，造模成功大鼠可見移植物內(nèi)出現(xiàn)液體積聚 （積液高度≥2 mm） ，呈隆起透亮的小囊泡，被結(jié)締組織或大網(wǎng)膜覆蓋并有血管形成，清晰可見，通常與周圍組織粘連緊密，故視為造模成功［8］。

1.2.2 模型組大鼠分組：選取建模成功的30只模型大鼠，隨機(jī)分為AT2R激動(dòng)劑CGP42112A低劑量組 （5 μ g·kg-1·d-1） 、中劑量組 （15 μ g·kg-1·d-1） 、高劑量組 （30 μ g·kg-1·d-1） 、AT1R阻滯劑氯沙坦組 （10 mg·kg-1·d-1） ，安慰劑對照組 （無菌注射用水） ，每組6只成模大鼠。各組按劑量每天腹腔注射給藥1次（氯沙坦灌胃） ，連續(xù)4周。

1.2.3 標(biāo)本的收集：各組相應(yīng)處理4周后，麻醉大鼠開腹，取腹主動(dòng)脈血，以3 000 r/min離心15 min，取血清分裝，于-80 ℃保存。分離周圍粘連組織，觀察異位結(jié)節(jié)大體形態(tài)并記錄，用游標(biāo)卡尺測量異位結(jié)節(jié)大小，根據(jù)公式體積 （mm3） =0.52×長×寬×高［9］，記錄各組處理后異位結(jié)節(jié)體積。同時(shí)留取異位結(jié)節(jié)，置于10%中性甲醛溶液中固定，常溫固定24 h后常規(guī)石蠟包埋，4 μ m厚度連續(xù)切片。

1.2.4 標(biāo)本檢測：

1.2.4.1 病灶體積 取下病灶組織，游標(biāo)卡尺測量移植物的長、寬、高，計(jì)算移植物體積，體積 （mm3） =0.52×長×寬×高，并再次記錄。

1.2.4.2 免疫組化法計(jì)數(shù)微血管密度（microvessel density，MVD） 采用免疫組織化學(xué)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物 （strept avidin-biotin complex，SABC） 法測定，以兔抗鼠CD34多克隆抗體染色的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，參照Weidner 微血管計(jì)數(shù)方法，在低倍鏡視野 （10倍） 下選取微血管密集度區(qū)，然后在高倍鏡視野下 （40倍） 計(jì)數(shù)所有的微血管，選取最大3個(gè)數(shù)值的平均數(shù)作為該例的MVD。

1.2.4.3 ELISA法檢測血清中VEGF及 TNF-α的含量采用雙抗體夾心ELISA法檢測，操作方法參照ELISA試劑盒說明書，利用酶標(biāo)儀得到吸光度OD值，再運(yùn)用CVXPT 32軟件包計(jì)算出濃度值，得到大鼠血清VEGF和TNF-α的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以描述，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMs模型建立情況

45只大鼠造模成功34只 （成功率75%） ，成模大鼠可見異位結(jié)節(jié)，個(gè)別大網(wǎng)膜粘連，腹壁可見異位病灶，呈充滿透明液體的透亮小囊泡，表面可見豐富血管走行，見圖1。

2.2 成模大鼠分組用藥后病灶體積比較

圖1 大鼠EMs模型Fig.1 The model of rat endometriosis

肉眼見實(shí)驗(yàn)組大鼠用藥后異位結(jié)節(jié)體積出現(xiàn)不同程度縮小，表面新生血管明顯減少，見圖2。高劑量組有2只大鼠異位結(jié)節(jié)萎縮，移植處僅見灰白色瘢痕組織。對照組異位灶體積無明顯改變。處理后中、高劑量組及氯沙坦組異位結(jié)節(jié)體積較安慰劑對照組明顯縮小 （P ＜ 0.01） ，低劑量組和安慰劑對照組間比較無明顯改變 （P ＞ 0.05） 。中、高劑量組與氯沙坦組異位結(jié)節(jié)體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P ＞ 0.05） ，表明ATR2對異位結(jié)節(jié)體積的影響呈劑量依賴性改變，見表1。

圖2 各組用藥處理后異位結(jié)節(jié)體積比較Fig.2 Representative images of endometriotic lesions in each group

表1 各組藥物處理后異位灶體積及MVD的比較 （±s，n = 6）Tab.1 Comparison of the volume and MVD in the rats in the different groups after treatment （，n = 6）

表1 各組藥物處理后異位灶體積及MVD的比較 （±s，n = 6）Tab.1 Comparison of the volume and MVD in the rats in the different groups after treatment （，n = 6）

1） P ＜ 0.05 vs control group；2） P ＜ 0.01 vs control group.

Parameter Control group Losartan group CGP42112A group Low-dose Middle-dose High-dose Volume 64.03±9.40 8.01±1.33 43.68±6.50 9.02±1.421） 8.82±1.391）MVD 33.66±1.23 11.94±0.75 27.27±1.99 14.83±0.612） 11.61±0.802）

2.3 AT2R對異位組織MVD值的影響

實(shí)驗(yàn)各組MVD較對照組明顯降低 （P ＜ 0.01） ，低劑量組和對照組間比較無明顯差異 （P ＞ 0.05） 。中、高劑量組與低劑量組及對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.01）；高劑量組與中劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05）；高劑量組及氯沙坦組MVD無明顯改變 （P ＞ 0.05） ，表明ATR2對MVD的影響呈劑量依賴性改變，見表1。

2.4 AT2R對血清VEGF、TNF-α表達(dá)的影響

處理后中、高劑量組治療后大鼠血清VEGF、TNF-α平均濃度較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） 。高劑量組與中劑量組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜ 0.05） ，表明ATR2對VEGF、TNF-α的影響在一定程度上也呈劑量依賴性改變，見表2。

3 討論

雖然EMs的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確［10］，但多個(gè)研究［11-12］結(jié)果表明其與血管再生及血管生成有密切關(guān)系，EMs病灶的種植、侵襲和生長關(guān)鍵在于新生血管生成來維持血液供應(yīng)［13］，從而促成EMs發(fā)病且反復(fù)發(fā)作。異位病灶內(nèi)部和周圍有大量特征性的新生血管，腹腔局部的血管生成活躍，本研究建立的大鼠EMs模型已充分證實(shí)這一點(diǎn)。因此通過抑制異位病灶血管生成來治療EMs已成為此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

表2 各組藥物處理后VEGF和TNF-α的濃度比較 （，pg/mL）Tab.2 Comparison of VEGF and TNF-α levels in the rats in the different groups after treatment （，pg/mL）

表2 各組藥物處理后VEGF和TNF-α的濃度比較 （，pg/mL）Tab.2 Comparison of VEGF and TNF-α levels in the rats in the different groups after treatment （，pg/mL）

1） P ＜ 0.01 vs control group；2） P ＜ 0.05 vs control group.

Parameter Control group Losartan group CGP42112A group Low-dose Middle-dose High-dose TNF-α 122.51±9.98 15.95±2.15 101.36±5.90 88.38±9.631） 38.53±5.052）VEGF 10.53±10.00 8.76±1.35 52.68±4.11 40.44±8.452） 17.33±1.881）

血管緊張素Ⅱ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要效應(yīng)器，是一種調(diào)節(jié)系統(tǒng)血壓以及體液和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)［14］，且已被證實(shí)存在于子宮內(nèi)膜組織中［15］，參與子宮內(nèi)膜的周期性變化及生殖功能的調(diào)節(jié)、維持妊娠期人體子宮穩(wěn)態(tài)等一系列生理過程；并參與功能性子宮內(nèi)膜出血、EMs、婦科腫瘤等病理生理過程［16］。血管緊張素Ⅱ被證實(shí)是促進(jìn)生理性及病理性血管生成的重要因子［17］，主要與AT1R、AT2R結(jié)合發(fā)揮作用，AT1R廣泛表達(dá)于血管組織，血管緊張素Ⅱ的大部分作用都是AT1R介導(dǎo)的，而AT2R在成人體內(nèi)低密度表達(dá)，主要表達(dá)于內(nèi)皮、血管平滑肌和神經(jīng)元細(xì)胞等［18］，且兩者作用在某些方面相反［19］，AT1R會(huì)提高醛固酮及血管加壓素的水平，促進(jìn)血管生成，增加血管阻力［20］，而AT2R的主要功能是血管舒張，抑制細(xì)胞增殖，并觸發(fā)緩激肽和硝酸鹽氧化物的釋放［21-22］。研究［23］發(fā)現(xiàn)，AT1R和AT2R均表達(dá)于EMs，且AT1/AT2 mRNA在EMs中的表達(dá)顯著高于非EMs的正常增生性子宮內(nèi)膜。進(jìn)一步研究［24］表明，激活的AT2R能通過與AT1R結(jié)合形成異質(zhì)二聚物來直接對抗AT1R介導(dǎo)的生理及病理效應(yīng)。自1994年第1個(gè)AT1R拮抗劑氯沙坦上市后，越來越多的AT1R拮抗劑被廣泛應(yīng)用于臨床，研究［25-26］發(fā)現(xiàn)，AT1R阻滯劑如氯沙坦能夠通過抑制VEGF的表達(dá)抑制血管生成，并且有可能抑制前列腺癌、乳腺癌及子宮內(nèi)膜癌的生長。替米沙坦能夠抑制血管生成，減少免疫細(xì)胞數(shù)量，抑制大鼠子宮內(nèi)膜異位結(jié)節(jié)的生長［27］且氯沙坦也在大鼠EMs試驗(yàn)中證實(shí)了這一點(diǎn)［28］。

有研究發(fā)現(xiàn)在EMs囊腫中AT2R的表達(dá)可以抑制AT1R的表達(dá)。換而言之，激動(dòng)AT2R可能對EMs新生血管的發(fā)生發(fā)展有抑制作用。為探明AT2R在EMs中對新血管形成的影響及作用，本研究通過Vernon法建立大鼠EMs模型，給予AT2R激動(dòng)劑CGP42112A，并同時(shí)設(shè)立AT1R拮抗劑氯沙坦作為陽性對照，觀察其對EMs微血管形成的影響。結(jié)果顯示，AT2R激動(dòng)劑與生理鹽水對照組比較，大鼠異位病灶的體積明顯縮小，還能抑制異位灶中MVD的數(shù)量和血清中VEGF、TNF-α的表達(dá)，且此種效應(yīng)有明顯地劑量依賴性，中高劑量組比低劑量組抑制血管生成的作用更加顯著。CGP42112A與AT1R拮抗劑氯沙坦作用一致，均有明顯的抑制異位病灶血管生成及縮小病灶體積的作用，且此作用可能與抑制VEGF、TNF-α的表達(dá)有關(guān)。由此可見，AT2R在EMs的藥物治療中有著廣泛的前景。但是參與血管生成的因子很多，且為一個(gè)復(fù)雜的過程，AT2R是否對其他血管生成因子也有作用以及這些血管生成因子之間的相互關(guān)系都有待深入研究。此外，AT2R對于EMs是否具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、止痛、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能等作用，有待進(jìn)一步研究，從而為臨床治療EMs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持，為開發(fā)治療藥物提供新的靶點(diǎn)。