康伊，張艷，張偉

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 1. 研究生學(xué)院； 2. 附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110032）

慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF） 患者通常由于血流動力學(xué)壓力增加，導(dǎo)致心臟病理性重塑而引發(fā)心功能逐漸惡化［1］。之前多項研究［2-3］表明，轉(zhuǎn)化生長因子β （transforming growth factor β，TGF-β） 家族蛋白與心臟重塑和心力衰竭高度相關(guān)。在心力衰竭過程中，TGF-β信號一方面抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成，另一方面則促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和纖維化。抗腫瘤藥阿霉素的心臟毒性就是由于阿霉素激活TGF-β表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而引發(fā)的［4］。早期研究［5］認(rèn)為，TGF-β信號抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的生物機(jī)制主要是TGF-β促進(jìn)細(xì)胞周期抑制因子p15INK和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子 （CDK inhibitor，CKI） 的表達(dá)。近期有研究［6］發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白激酶ULK1可磷酸化細(xì)胞周期分子伴侶Cdc37并導(dǎo)致CDK4和AuroraB的降解，從而抑制細(xì)胞周期。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號通路能夠在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性上調(diào)ULK1蛋白表達(dá)，上調(diào)作用是通過促進(jìn)ULK1蛋白合成實現(xiàn)的，敲低ULK1表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖加快和S/G2期細(xì)胞比例明顯提高。這提示ULK1蛋白可成為TGF-β信號通路調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVEC） 、人微血管內(nèi)皮細(xì)胞 （human microvascular endothelial cells 1，HMEC-1） 和人胚胎腎細(xì)胞 （human embryonic kidney 293T，HEK293T） 購自ATCC。HMEC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清 （fatal bovine serun，F(xiàn)BS） 的DMEM 培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。HUVEC 細(xì)胞從液氮凍存罐中取出，置于37 ℃水浴中迅速解凍，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入4 mL含10% FBS 的1640 完全培養(yǎng)基，充分混合，1 000 r/min離心3 min。用5 mL 1640完全培養(yǎng)基重懸于37 ℃、5% CO2的條件下靜置沉淀，6 h 細(xì)胞貼壁生長后換液。在培養(yǎng)3～6代時進(jìn)行TGF-β處理實驗。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)化和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建

構(gòu)建針對人源ULK1 shRNA的pCDNA3.1質(zhì)粒，shRNA 序列為 5’-GCACAGAGACCGTGGGCAA-3’，利用Lipofectamine2000 （Invitrogen） 將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HMEC-1細(xì)胞中，并用800 μ g/mL 的G418進(jìn)行篩選。1個月后用無菌槍頭挑取陽性單克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，利用Western blotting驗證敲低效率，并以篩選轉(zhuǎn)染pCDNA3.1空質(zhì)粒的HMEC-1細(xì)胞作為對照。

1.3 免疫印跡實驗

等量的上樣蛋白經(jīng)8%SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用含5% BSA 的TBST 室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。用0.1% TBST 洗膜3 次，每次15 min，加入相應(yīng)的HRP 標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜后以Supersignal West Femto/Pico HRP 敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。以Tubulin蛋白作為內(nèi)參對照。

1.4 細(xì)胞流式分析實驗

將TGF-β處理過的HMEC-1細(xì)胞用PBS 洗滌1～2次后，加入1 mL 含0. 25%胰酶的細(xì)胞消化液，于37℃條件下消化15 min。消化完全后加入20 μ L 胎牛血清終止消化反應(yīng)，2 000 r/min離心5 min，去除上清液，下層細(xì)胞用PBS 洗滌1 次，棄上清液，緩慢加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇溶液，吹吸均勻后置于4 ℃冰箱中固定24 h。固定后細(xì)胞離心洗滌2～3次，加入5 μ L RNA酶37 ℃水浴30 min，離心棄上層清液，緩慢加入0. 4 mL PBS 溶液吹吸均勻，加入5 μ L 碘化丙啶染液，4 ℃染色0.5 h 后上機(jī)檢測。使用流式細(xì)胞儀 （ BD FACS Calibur） 進(jìn)行檢測，依據(jù)檢測情況設(shè)定FSC-Height 等參數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TGF-β在血管內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)ULK1蛋白表達(dá)

在HUVEC和HMEC-1細(xì)胞中分別加入2 ng/mL TGF-β處理內(nèi)皮細(xì)胞6 h，利用Western blotting 檢測ULK1蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TGF-β能夠明顯上調(diào)ULK1蛋白的表達(dá) （圖1A、B） 。利用ShRNA在HMEC-1細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定敲低ULK1基因的細(xì)胞株，表明TGF-β在HMEC-1細(xì)胞中上調(diào)ULK1表達(dá)的特異性（圖1C） 。同時TGF-β上調(diào)ULK1具有細(xì)胞特異性，在上皮細(xì)胞系HEK293T中TGF-β不能刺激ULK1的表達(dá)（圖1D） 。TGF-β上調(diào)ULK1表達(dá)主要通過增加蛋白合成的方式，利用放線菌酮 （cycloheximide，CHX） 處理可在HUVEC細(xì)胞中抑制TGF-β對ULK1的上調(diào)作用（圖1E） ，而在HMEC-1細(xì)胞中TGF-β以濃度依賴方式不斷增強(qiáng)ULK1的表達(dá) （圖1F） 。

2.2 ULK1參與抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期

通過構(gòu)建穩(wěn)定敲低ULK1基因的HMEC-1細(xì)胞株，并用流式細(xì)胞儀分析同步化后ULK1基因敲低型和野生型內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲低ULK1可以明顯促進(jìn)HMEC-1細(xì)胞進(jìn)入S和G2/M期，減少G1期細(xì)胞比例，見圖2、表1。

3 討論

CHF是多種心臟疾病發(fā)展的終末階段，心臟重塑無疑對CHF產(chǎn)生了重要影響，而血管內(nèi)皮細(xì)胞正常增殖和保持分泌平衡的功能狀態(tài)對于維持血管正常功能、防止心血管疾病的發(fā)生具有重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有重要的分泌合成和調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞生長的功能，血管內(nèi)皮細(xì)胞可分泌一氧化氮、前列環(huán)素以及內(nèi)皮衍生超極化因子等調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖，進(jìn)而調(diào)控心臟血管重塑和心肌重塑［7］。

圖1 TGF-β在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)ULK1蛋白表達(dá)Fig.1 TGFβ- upregulates ULK1 expression in endothelial cells

圖2 ULK1基因敲低促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖Fig.2 ULK1 knockdown promotes cell cycle of endothelial cells

表1 各組TGF-β處理后細(xì)胞周期百分比比較Tab.1 Comparison of cell cycle percentages in different groups after TGF-β treatment

TGFβ-信號通路是一個包含眾多成員的多功能細(xì)胞因子大家族，該信號通路主要由各種TGF-β細(xì)胞蛋白配體結(jié)合細(xì)胞外T β R-Ⅱ受體，T β R-Ⅱ結(jié)合并激活T β R-I受體進(jìn)而磷酸化下游的信使蛋白Smad2/3，激活的Smad2/3與Smad4形成復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和組織纖維化等重要的生理病理過程［8-9］。前期研究［10］表明，TGF-β對于促進(jìn)心肌肥大和心臟纖維化具有重要作用，TGF-β 1過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出顯著的心肌肥大和小腸纖維化表型，而TGF-β 1+/-轉(zhuǎn)基因小鼠可以抵御隨年齡帶來的心臟纖維化和舒張功能障礙［11］。近期幾項研究［12］表明，TGF-β 1配體可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。TGF-β信號通路抑制細(xì)胞增殖的方式是TGF-β能降低Cyclins和CDKs的活性與表達(dá)水平，同時也可誘導(dǎo)CKIs的表達(dá)來實現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯［13］，但是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中TGF-β是否還具有其他機(jī)制調(diào)節(jié)其增殖還有待進(jìn)一步研究。

ULK1蛋白最早作為酵母中自噬通路關(guān)鍵蛋白Atg1的同源物被鑒定出來，是一個重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［14］。ULK1蛋白在哺乳動物細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，ULK1與Atg13、FIP200形成蛋白復(fù)合物調(diào)控自噬體的早期形成，同時ULK1作為蛋白激酶還能磷酸化另一個自噬起始復(fù)合物Beclin1-Vps34復(fù)合物［15］。最近研究［16］還發(fā)現(xiàn)，ULK1有非自噬依賴的功能。ULK1能夠磷酸化AMPK β 1亞基108位的絲氨酸，進(jìn)而調(diào)控代謝壓力下的細(xì)胞周期并且促進(jìn)細(xì)胞存活；更有趣的是，ULK1可直接磷酸化細(xì)胞周期伴侶蛋白Cdc37的339位絲氨酸位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控Cdc37-Hsp90分子伴侶復(fù)合體的活性，最終加速細(xì)胞周期重要調(diào)控蛋白Cdk4、Cdk6、pRb和AuroraB的降解，抑制細(xì)胞增殖。ULK1加速Cdk4和Cdk6等蛋白的降解并不是通過自噬過程實現(xiàn)的，敲除Atg3并不能阻止ULK1對Cdk4和Cdk6的降解作用［6］。以上研究表明ULK1可能以非自噬依賴的方式調(diào)控細(xì)胞周期。

本研究首次在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)TGF-β信號通路可以特異性地上調(diào)ULK1蛋白的表達(dá)，而上調(diào)作用是通過促進(jìn)ULK1蛋白合成而不是通過抑制其降解實現(xiàn)的；ULK1蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可以有效抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。對于ULK1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否也通過磷酸化Cdc37，進(jìn)而通過影響Cdc37-Hsp90復(fù)合物活性調(diào)控細(xì)胞周期，還需要進(jìn)一步探討和研究。本研究表明TGF-β除了調(diào)控細(xì)胞周期抑制因子之外，還可通過ULK1蛋白激酶影響細(xì)胞周期。有研究［6，16］表明，ULK1除了在自噬通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在調(diào)控細(xì)胞周期方面也發(fā)揮著重要作用。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞對心肌細(xì)胞具有重要的保護(hù)機(jī)制，開發(fā)針對ULK1激酶的小分子抑制劑，對臨床治療CHF有一定的潛在價值。