冒玉娟， 邢曉玲， 沈小艮， 何晉瑤

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生活水平的提高，食品安全問題引起了全社會(huì)的廣泛重視，采取有效的檢測(cè)手段對(duì)動(dòng)物源食品中藥物殘留問題進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及監(jiān)督控制是保障人們“舌尖上”安全的重要舉措。阿維菌素類藥物(avermectins，AVMs)是由鏈霉素產(chǎn)生的一組類似于大環(huán)內(nèi)酯類藥物的物質(zhì)，由于有殺蟲活性強(qiáng)[1-2]、殺蟲譜廣的特點(diǎn)，成為現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)上用量最大的抗寄生蟲藥物[3]。目前，已商品化的主要品種有阿維菌素(avermectin，AVM)、伊維菌素(ivermectin，IVM)、多拉菌素(dommectin，DOR)、埃普菌素(eprinomectin，EPR)、莫西丁克(mox-idectin，MOX)和塞拉菌素(selamectin，SEM)[4]。雖然，阿維菌素類藥物的作用劑量較小(ng/kg級(jí))，但是此類藥物的脂溶性較高，而且具有神經(jīng)毒性和發(fā)育毒素，在體內(nèi)殘留時(shí)間較長(zhǎng)，因此按照世界衛(wèi)生組織(WHO)5級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，仍將其列為高毒化合物[5]。幾乎每個(gè)國(guó)家都有食品中AVMs殘留限量(MRL)的規(guī)定，歐盟(EU)、美國(guó)(US)、聯(lián)合國(guó)食品法典委員會(huì)(CAC)和我國(guó)都制定了阿維菌素類藥品在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的農(nóng)藥最高殘留限量(MRL)，歐盟為15 μg/kg、美國(guó)為20 μg/kg、聯(lián)合國(guó)食品法典委員會(huì)和許多國(guó)家對(duì)該類化合物的殘留限量為 10 μg/kg[6-7]。

阿維菌素類藥物相對(duì)分子量較大，氣化困難，且尚無(wú)可行的氣相色譜分析方法。目前，檢測(cè)方法主要有免疫親和色譜技術(shù)(IAC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、液相色譜法(HPLC)等。免疫親和色譜技術(shù)需要選擇合適的抗體固定方式，在洗脫待測(cè)抗原時(shí)應(yīng)保證固定的抗體不被解離下來(lái)，試驗(yàn)成本較昂貴；酶聯(lián)免疫吸附法的最低檢測(cè)限較低，可以滿足阿維菌素類藥物殘留的檢測(cè)，但是免疫分析檢測(cè)具有一定的盲目性，以及抗體依賴于國(guó)外進(jìn)口等因素的影響，使酶聯(lián)免疫法的廣泛應(yīng)用受到限制；HPLC技術(shù)是阿維菌素類較為常用的藥物分析技術(shù)，其中HPLC-DAD檢測(cè)法靈敏度低，無(wú)法精確檢測(cè)殘留量；HPLC-FLD光檢測(cè)法是國(guó)內(nèi)目前使用最廣泛的阿維菌素類藥物殘留的檢測(cè)方法[7]，但是樣品前處理復(fù)雜，需要進(jìn)行衍生化，花費(fèi)較高。近年來(lái)，UPLC-MS/MS法在國(guó)內(nèi)外屢見報(bào)道，此法將超高效液相色譜的高速、高分離度與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度相結(jié)合，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)目標(biāo)物，具有高選擇性、高靈敏度、高通量的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)樣品采用蛋白沉淀法前處理，建立UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定雞肉中伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素多殘留的檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)，可滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物源食品中阿維菌素類藥物殘留的定性、定量檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

伊維菌素對(duì)照品(批號(hào)：k0191406)、阿維菌素對(duì)照品(批號(hào)：k0361505)、多拉菌素對(duì)照品(批號(hào)：k0461411)、乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品(批號(hào)：k0471411)均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；伊維菌素原料藥、乙酰氨基阿維菌素原料藥，河北威遠(yuǎn)動(dòng)物藥業(yè)有限公司；阿維菌素粉(2%)，江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司；多拉菌素原料藥，江蘇凌云藥業(yè)有限公司；乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；二甲基亞砜(DMSO)，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，色譜純，Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高液相色譜儀(日本島津超高液相LC-30AD系列)；API 4000 Q-trap三重四級(jí)桿/離子阱質(zhì)譜儀包含電噴霧電離源(ESI源)(美國(guó)Applied Biosystem公司)；CTC PAL自動(dòng)進(jìn)樣器(CTC Analytics，AG，瑞士)；FA25型高速勻漿機(jī)(Fluko公司)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

雛雞，購(gòu)自江蘇泰州某孵化場(chǎng)，選擇無(wú)抗飼料飼養(yǎng)至30日齡。分為2組，一組給以伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素粉，均按照說明書劑量拌料給藥，連用3 d；另一組為對(duì)照組，不給以任何藥物。分別在給藥后3 d，剖殺，取各組肌肉，-20 ℃保存，備用。

1.4 方法

1.4.1 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 精確稱取伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品適量，分別置于 20 mL 的容量瓶中，用DMSO溶解并定容，超聲促溶，并充分搖勻，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用移液槍各取100 μL于600 μL乙腈中，配制成100 μg/mL的混合工作液。用乙腈梯度稀釋至10.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.08、0.04 μg/mL的混合系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4.2 空白肌肉勻漿液 稱取一定量的雞空白肌肉樣品，剪碎，加入5倍體積的50%乙腈，樣品置于冰浴上，用高速勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿處理，得均一的勻漿液。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的前處理 取5 μL系列標(biāo)準(zhǔn)工作液(10.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.08、0.04 μg/mL)加入 50 μL 的空白肌肉勻漿液中，渦旋30 s，加入150 μL乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，使蛋白充分沉淀，于4 ℃的離心機(jī)中 14 000 r/min 離心10 min，取150 μL上清加入150 μL超純水中，混合均勻后，待進(jìn)樣。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的系列濃度為4、8、20、50、200、500、1 000 ng/mL；肌肉勻漿為5倍體積勻漿液，故在肌肉中的定量范圍為20、40、100、250、1 000、2 500、5 000 ng/g。

1.4.4 給藥雞肌肉樣品前處理 取給藥肌肉勻漿液50 μL，加入5 μL乙腈，以與空白添加樣品(即標(biāo)準(zhǔn)曲線)的基質(zhì)保持一致，加入150 μL乙腈溶液，渦旋振蕩3 min，于4 ℃的離心機(jī)中14 000 r/min離心10 min，取150 μL上清加入150 μL超純水中，混合均勻后，待進(jìn)樣。

1.4.5 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 UPLC色譜條件：色譜柱為waters XTerra C18(150 mm×2.1 mm，ID 5 μm)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸的超純水；流動(dòng)相B：0.1%甲酸的乙腈；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。質(zhì)譜離子源參數(shù)：CUR：20.00，CAD：6、IS：5 500.00，TEM：500.00，GS1：50.00，GS2：60.00，ihe：ON。4種化合物質(zhì)譜參數(shù)見表2。質(zhì)譜采集與分析軟件：Analyst 1.4.2。

表2 4種化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.4.6 添加回收率 在空白雞肉中，分別添加50、500、4 000 ng/g 3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平的伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素對(duì)照品，每個(gè)質(zhì)量濃度水平做3個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算4種物質(zhì)的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

伊維菌素中B1a含量高，其準(zhǔn)確分子量為874.5；阿維菌素中B1a含量高其準(zhǔn)確分子量為872.5；多拉菌素中B1b含量高，其準(zhǔn)確分子量為898.5；乙酰氨基阿維菌素中的B1a的含量高，其準(zhǔn)確分子量為913.5。

預(yù)先配制100、500、1 000 ng/mL的3個(gè)質(zhì)量濃度的伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素以及乙酰氨基阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)溶液以流動(dòng)注射的方式在正離子模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜母離子全掃描，分子離子m/z分別為897.8、895.8、921.8、936.8，均為[+Na+]的分子離子峰，其中500 ng/mL的分子離子響應(yīng)在106計(jì)數(shù)/s附近，即為最佳優(yōu)化濃度，故以500 ng/mL的濃度在正離子模式下進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化確定最高以及次高響應(yīng)的二級(jí)離子m/z以及相應(yīng)DP、CE、CXP 3個(gè)參數(shù)，具體見表2。最終優(yōu)化ESI源的碰撞電壓、離子化溫度、氣簾氣等參數(shù)。本研究中為保證4個(gè)化合物在同樣的分析條件下，信號(hào)接近，在最終定量分析時(shí)伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素選用的離子對(duì)分別為897.8/753.9、895.8/751.9、921.8/777.6、936.8/490.6。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素屬于弱極性化合物，極易溶解于甲醇、乙腈，故此方法的建立選用反相色譜柱。本研究以含0.1%甲酸的超純水作為水相，0.1% 甲酸能促進(jìn)分子的電離，大大增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)度；以乙腈作為有機(jī)相，隨著有機(jī)相比例的提高，目標(biāo)物保留時(shí)間縮短，但色譜峰比較寬，靈敏度會(huì)隨之降低，若提高流速則保留時(shí)間太短分離效果比較差，故最終選擇梯度洗脫，以相對(duì)高的流速低比例的有機(jī)相作為起始流動(dòng)相，既能在合適的時(shí)間內(nèi)將4個(gè)化合物很好地分離，同時(shí)又提高了分析效率以及檢測(cè)的靈敏度。

2.3 樣品的提取

在動(dòng)物組織樣品中，阿維菌素類藥物提取的常用溶劑為乙腈、甲醇、丙酮、甲苯和乙酸乙酯等。本試驗(yàn)使用較為簡(jiǎn)單的乙腈蛋白沉淀法，過程提取回收率約95%，符合要求，且步驟簡(jiǎn)單，能大大提高樣品前處理的效率。

2.4 方法的線性范圍、定量限和檢測(cè)限

按“1.4.3”方法處理標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，進(jìn)樣10 μL，在本方法所確定的試驗(yàn)條件下，利用Analyst 1.4.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集與分析。以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)x、峰面積為縱坐標(biāo)y進(jìn)行線性回歸，權(quán)重因子為1/x2，測(cè)定20 ng/g加標(biāo)空白樣品4種藥物定量離子信噪比，并用外推法計(jì)算最低檢出限，結(jié)果表明4種阿維菌素類藥物殘留在20～5 000 ng/g的范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系(圖1至圖4)，得到4種藥品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限(表3)。定量下限的信噪比分別為15.5、26.0、18.5、19.0，參見圖5至圖8，符合信噪比(RS/N)>10作為定量下限的要求。

表3 4種阿維菌素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 添加回收率

4種藥物在50、500、4 000 μg/g添加水平下，平均回收率在92.89%～94.68%之間，RSD在1.26%～1.94%之間，說明本方法可以滿足雞肉中同時(shí)檢測(cè)伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素的要求，方法回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。

表4 伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素的加標(biāo)回收率

2.6 給藥動(dòng)物肌肉中藥物濃度的測(cè)定

給藥樣品經(jīng)處理后進(jìn)樣，利用Analyst 1.4.2軟件計(jì)算得到雞肉樣品中伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為126、105、134、141 ng/g(圖9)。

3 結(jié)論

有關(guān)雞肉中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)報(bào)道很少， 但在其他有關(guān)動(dòng)物組織中阿維菌素類藥物殘留檢測(cè)方法報(bào)道很多，如李欣等采用UPLC-MS/MS建立牛肝中阿維菌素類藥物的多殘留檢測(cè)方法，以乙腈提取、氮?dú)獯蹈?、疏水的甲基丙烯酸丁?乙二醇二甲基丙烯酸酯整體柱作為固相萃取介質(zhì)，其平均回收率在77.4%～98.4%[8]，而本法僅取0.2～0.5 g樣品，經(jīng)50%乙腈高速勻漿后，取50 μL勻漿樣品，加入5 μL乙腈離心去蛋白，無(wú)需脫脂和固相萃取等操作，且無(wú)需氮吹濃縮。本方法操作簡(jiǎn)單，出峰時(shí)間在4～5 min，分析快速，且方法的最低檢測(cè)限低于聯(lián)合國(guó)食品法典委員會(huì)(CAC)和我國(guó)對(duì)該類化合物的殘留限量10 ng/g。本研究建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)禽肉中伊維菌素、阿維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素殘留檢測(cè)方法回收率、準(zhǔn)確率高，能完全滿足禽肉中阿維菌素類藥物的殘留檢測(cè)與確證的需要。