鄒立飛 余小蘭 鄒雨坤 李光義 李曉亮 鄭鵬 李勤奮

摘要：【目的】優(yōu)化甜瓜枯萎病拮抗鏈霉菌D2菌株的發(fā)酵條件，為該菌發(fā)酵方法的建立及工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以D2菌株有效活菌數(shù)為考察指標(biāo)，玉米粉含量、豆餅粉含量、pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和溫度為影響因素，利用響應(yīng)面法對D2菌株的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】豆餅粉含量、玉米粉含量和溫度對D2菌株有效活菌數(shù)有顯著影響（P<0.05）。D2菌株有效活菌數(shù)回歸模型為：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32（式中，Y為有效活菌數(shù)對數(shù)，X1、X2和X3分別為玉米粉含量、豆餅粉含量和溫度的編碼值），理論有效活菌數(shù)為2.99×108 CFU/mL。D2菌株最優(yōu)發(fā)酵條件為：玉米粉含量39.08 g/L、豆餅粉含量39.19 g/L、培養(yǎng)溫度37.4 ℃，在此條件下D2菌株有效活菌數(shù)為3.01×108 CFU/mL，與理論值接近，但極顯著高于未經(jīng)優(yōu)化采用培養(yǎng)基Ⅱ得到的有效活菌數(shù)（1.0×106 CFU/mL）（P<0.01）?！窘Y(jié)論】采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的D2菌株發(fā)酵條件可有效提高該菌株有效活菌數(shù)，且回歸模型推算出的理論活菌數(shù)與優(yōu)化條件發(fā)酵的有效活菌數(shù)接近，可用于指導(dǎo)D2菌株的實際規(guī)模化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 甜瓜枯萎病；拮抗菌；鏈霉菌；響應(yīng)面法；發(fā)酵條件

中圖分類號： S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-0905-07

Abstract：【Objective】The present study aimed to explore an optimal fermentation condition of streptomyces strain D2 that was against muskmelon fusarium wilt so as to provide scientific basis for the establishment of the strain fermentation method and industrial production. 【Method】The viable bacteria number of strain D2 was taken as the indicator of the investigation， and influencing factors included corn powder content， soybean powder content， pH， rotation speed， inoculation amount and temperature. The fermentation condition of strain D2 was optimized by employing the combination of Plackett-Burman（P-B） design， uphill path method， central composite design（CCD） and response surface method. 【Result】The results showed that corn powder content， soybean powder content and temperature significantly affected viable bacteria number of strain D2（P<0.05）. The regression model of viable bacteria number of strain D2 was：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32 ， and the viable bacteria number was 2.99×108 CFU/mL in theory. The optimal fermentation conditions for strain D2 was： corn powder content 39.08 g/L， soybean powder content 39.19 g/L and culture temperature 37.4 ℃. Under these conditions， the viable bacteria number of strain D2 was 3.01×108 CFU/mL， which was close to the theoretical content，but was extremely significant higher than the viable bacteria number（1.0×106 CFU/mL） obtained by using mediumⅡwithout optimization（P<0.01）. 【Conclusion】The optimum fermentation culture technique for strain D2 optimized by response surface method can effectively improve the viable bacteria number. The viable bacteria number predicted by regression model is close to the actual number fermented under the optimized fermentation condition. Therefore， this model can be used to predict the fermentation of D2 strains in practical production.

Key words：muskmelon fusarium wilt； antagonistic bacteria； streptomyces； response surface method； fermentation condition

0 引言

【研究意義】甜瓜枯萎病是主要由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的一種土傳病害（南宇航等，2016），可危及甜瓜整個生育期，以開花到結(jié)果期發(fā)病最嚴(yán)重，常造成大片瓜田絕收甚至植株死亡（黃美蓮，2006）。如何有效預(yù)防并控制甜瓜枯萎病害發(fā)生，是當(dāng)前甜瓜種植產(chǎn)業(yè)的重要任務(wù)之一。目前，甜瓜枯萎病的防治主要使用硫酸銅（牛夢天，2016）、高錳酸鉀（Xu et al.，2012；馬振玲，2016）、惡霉靈（楊長成等，2010）和枯萎寧（周小林等，2007）等化學(xué)藥劑，但這些化學(xué)藥劑無法從根本上殺滅病菌，且農(nóng)藥殘留會影響甜瓜果實的質(zhì)量安全（?zbah?e et al.，2014）。生物防治因防治效果較好且具有環(huán)保、無藥害等特點，開發(fā)應(yīng)用潛力巨大。鏈霉菌是一類重要的生防菌資源，可直接或間接產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，從而達(dá)到防控枯萎病的效果。因此，優(yōu)化鏈霉菌株發(fā)酵工藝參數(shù)，對鏈霉菌制劑的規(guī)模化生產(chǎn)及甜瓜枯萎病害的有效防控具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】前人已從不同環(huán)境篩選出多株對植物枯萎病菌具有拮抗作用的鏈霉菌菌株。Li等（2012）從土壤中篩選到一株拮抗鏈霉菌（Streptomyces sp.），將該菌制成發(fā)酵液后應(yīng)用于黃瓜枯萎病防治上效果顯著；甘良等（2015）分離篩選獲得兩株鏈霉菌菌株153和SF6，并證實二者對茄子和番茄枯萎病的防治效果分別達(dá)83.72%和69.85%；閆建芳等（2016）將篩選到的生防鏈霉菌應(yīng)用于黃瓜上，發(fā)現(xiàn)其對枯萎病的相對防效在65%以上。因此，將鏈霉菌應(yīng)用于枯萎病的生物防治具有較大的研究及應(yīng)用價值（孫建龍等，2012）。目前，優(yōu)化拮抗菌培養(yǎng)條件是提高其抑菌能力、增加產(chǎn)量的一條重要途徑（Lara et al.， 2006；Desai et al.，2008），而響應(yīng)面法因結(jié)合數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法，能全面考慮各因素間交互作用，且具有工作量小、時間短、優(yōu)化效果好等特點，已成功應(yīng)用于微生物功能菌的培養(yǎng)基優(yōu)化（Lu et al.， 2009）。孫沙沙等（2013）采用單因素試驗與響應(yīng)面法相結(jié)合的方法對煙草野火病拮抗菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其拮抗效果提高25.72%。張艷敏等（2016）采用響應(yīng)面法對褐黃孢鏈霉菌ZM701發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，其納他霉素產(chǎn)量可提高77.8%?！颈狙芯壳腥朦c】目前，國內(nèi)外對甜瓜枯萎病的生物防治報道中多數(shù)是利用細(xì)菌和真菌進(jìn)行防治，而采用放線菌防治的報道較少。此外，相對于正交試驗和單因素試驗法，響應(yīng)面法具有工作量小、精確度高等特點，更適合于微生物功能菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】D2菌株是本研究團(tuán)隊從海南露地栽培厚皮甜瓜根際土壤中篩選獲得的一株利迪鏈霉菌，經(jīng)盆栽防效試驗證實該菌株對甜瓜枯萎病的防治效果達(dá)73.53%（鄒立飛，2013）。本研究以D2菌株有效活菌數(shù)為考察指標(biāo)，玉米粉含量、豆餅粉含量、pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和溫度為影響因素，利用Design Expert 7.0響應(yīng)面法對D2菌株進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計，以期為該菌發(fā)酵方法的建立及工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試菌株 供試?yán)湘溍咕鶧2菌株為本研究團(tuán)隊從海南露地栽培厚皮甜瓜的根際土壤中篩選獲得。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基Ⅰ：可溶性淀粉20.00 g/L、KNO3 1.00 g/L、KH2PO3 0.50 g/L、NaCl 0.50 g/L、MgSO4 0.50 g/L、FeSO4 0.01 g/L、pH 7.2～7.4；培養(yǎng)基Ⅱ：玉米粉32.00 g/L、豆餅粉32.00 g/L、KH2PO3 0.50 g/L、NaCl 0.50 g/L、MgSO4 0.50 g/L、FeSO4 0.01 g/L、pH 7.2～7.4。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 種子液制備 將保存在-4 ℃條件下的D2菌株接種至培養(yǎng)基Ⅰ，置于38 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基Ⅰ中，再次置于38 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，即得所需種子液。

1. 2. 2 發(fā)酵液制備 將1.2.1制備的種子液轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基Ⅱ中，按試驗設(shè)計的發(fā)酵條件進(jìn)行培養(yǎng)，即得所需發(fā)酵液。另外，在發(fā)酵液培養(yǎng)72 h時，取樣測定D2菌株的有效活菌數(shù)。

1. 2. 3 發(fā)酵條件優(yōu)化設(shè)計

1. 2. 3. 1 P-B試驗設(shè)計 采用Plackett-Burman（P-B）試驗設(shè)計對影響D2菌株有效活菌數(shù)的7個因素進(jìn)行研究，具體試驗設(shè)計見表1，其中，水平-1為D2菌株常規(guī)培養(yǎng)條件，水平+1為水平-1的1.25倍；1個單位無機(jī)鹽含量為0.50 g/L KH2PO3、0.50 g/L NaCl、0.50 g/L MgSO4、0.01 g/L FeSO4。

1. 2. 3. 2 最陡爬坡試驗 根據(jù)P-B試驗結(jié)果確定的影響D2菌株發(fā)酵的主要因子設(shè)計變化方向和步長，以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值確定變化步長，從而逼近最大響應(yīng)區(qū)域，最終確定D2菌株有效活菌數(shù)最高的發(fā)酵條件（鄒立飛，2013）。

1. 2. 3. 3 CCD設(shè)計 應(yīng)用Design Expert 7.0，以最陡爬坡試驗篩選的玉米粉含量、豆餅粉含量和溫度為變量，對發(fā)酵試驗進(jìn)行CCD設(shè)計（表2）， 即可得到D2菌株發(fā)酵過程的二次方程模型。該模型可對變量的響應(yīng)行為進(jìn)行表征，并對3個發(fā)酵條件[玉米粉含量（x1）、豆餅粉含量（x2）、溫度（x3）]進(jìn)行響應(yīng)面分析，從而得到D2菌株最優(yōu)發(fā)酵條件。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Design Expert 7.0和SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1. 4 回歸模型驗證

根據(jù)響應(yīng)面法得到的最優(yōu)發(fā)酵條件對D2菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完成后，取樣測定D2菌株有效活菌數(shù)。通過測定其有效活菌數(shù)判定是否與回歸模型推算出的理論活菌數(shù)一致。

2 結(jié)果與分析

2. 1 P-B試驗結(jié)果分析

P-B試驗設(shè)計及相關(guān)響應(yīng)值見表3和表4。由表3和4可知，各因素對D2菌株有效活菌數(shù)的影響力表現(xiàn)為：豆餅粉含量>玉米粉含量>溫度>無機(jī)鹽含量>搖床轉(zhuǎn)速>接菌量=初始pH，且豆餅粉含量、玉米粉含量和溫度均達(dá)顯著水平（P<0.05）。由此可確定影響D2菌株有效活菌數(shù)的主要因素是豆餅粉含量、玉米粉含量和溫度。

2. 2 最陡爬坡試驗結(jié)果分析

最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果見表5。由表5可知，當(dāng)玉米粉含量37.00 g/L、豆餅粉含量37.00 g/L、溫度37.0 ℃時，D2菌株有效活菌數(shù)達(dá)最大值（1.94×108 CFU/mL），故以處理2作為CCD設(shè)計的中心點進(jìn)行試驗設(shè)計。

2. 3 CCD試驗結(jié)果分析

CCD試驗設(shè)計及相關(guān)結(jié)果見表6、表7、圖1、圖2和圖3。由表6和表7可知，對玉米粉含量、豆餅粉含量和溫度進(jìn)行優(yōu)化后，最終得到回歸模型（響應(yīng)方程）為：Y=8.28757+0.12344X1+0.21477X2+0.06184X3-0.05929X12-0.09817X22-0.14942X32。當(dāng)X1=1.04、X2=1.09、X3=0.21時，即Y最大，相對應(yīng)的D2菌株理論有效活菌數(shù)為2.99×108 CFU/mL。由圖1、圖2和圖3可知，當(dāng)溫度37.4 ℃、豆餅粉含量39.19 g/L、玉米粉含量39.08 g/L時，相應(yīng)的由玉米粉和豆餅粉含量、玉米粉含量和溫度、豆餅粉含量和溫度分別構(gòu)成的空間點在距離最優(yōu)點較遠(yuǎn)處其上升速度大，距離近時上升速度小，故可確定玉米粉含量、豆餅粉含量和溫度的最佳值分別為39.08 g/L、39.19 g/L和37.4 ℃。

2. 4 回歸模型驗證結(jié)果分析

為驗證回歸模型預(yù)測的準(zhǔn)確性，用培養(yǎng)基Ⅱ及優(yōu)化后培養(yǎng)基進(jìn)行實際發(fā)酵培養(yǎng)試驗，結(jié)果表明，當(dāng)玉米粉含量39.08 g/L、豆餅粉含量39.19 g/L、溫度37.4 ℃時得到的實際有效活菌數(shù)為3.01×108 CFU/mL，與回歸模型推算出的理論活菌數(shù)（2.99×108 CFU/mL）接近，且極顯著（P<0.01）高于未經(jīng)優(yōu)化采用培養(yǎng)基Ⅱ得到的有效活菌數(shù)（1.0×106 CFU/mL），故該模型可用于指導(dǎo)D2菌株的實際生產(chǎn)。

3 討論

影響微生物發(fā)酵的因子主要有碳源、氮源、溫度、接菌量、搖床轉(zhuǎn)速、pH和無機(jī)鹽含量等，其中碳源和氮源是微生物發(fā)酵的必需材料（趙能等，2016；王法國等，2017），但不同微生物在其生長過程中對碳和氮種類選擇存在明顯差異（宋瑛瑛等，2016；易子霆等，2016；楊冬靜等，2017）。此外，溫度（文凱，2016）、接菌量、搖床轉(zhuǎn)速、pH（陳令等，2014）和無機(jī)鹽含量等也會影響菌株發(fā)酵過程。本研究采用P-B試驗設(shè)計對影響D2菌株發(fā)酵條件的7個因子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)玉米粉（碳源）含量、豆餅粉（氮源）含量和溫度是影響D2菌株發(fā)酵的主要因素，并對這3個主要因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得D2菌株的最優(yōu)發(fā)酵條件。不同鏈霉菌菌株采用該方法確定影響發(fā)酵的主要因子存在明顯差異，如影響鏈霉菌菌株HD-010發(fā)酵的主要因素是葡萄糖、蔗糖（碳源）、玉米粉（氮源）和接種量（張海秀，2009），影響小鏈霉菌發(fā)酵的主要因素是溫度、初始pH和裝瓶量（孫建龍等，2012），而溫度、接菌量、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時間是影響鏈霉菌組合ST-2發(fā)酵的主要因素（閆建芳等，2016）?？梢姡绊懓l(fā)酵的主要因素是由菌種自身的遺傳特征和生理特性決定，同時，微生物普遍具有一定的局域適應(yīng)性，導(dǎo)致不同生境下獲取的菌株具有其特有的最優(yōu)發(fā)酵條件。因此，開展微生物發(fā)酵工作時必須充分認(rèn)識不同菌株之間的特異性，有針對性地明確影響其發(fā)酵的主要因素，為優(yōu)化目標(biāo)菌株的發(fā)酵條件做準(zhǔn)備。

目前，普遍采用響應(yīng)面法對微生物發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計（Ambat and Ayyanna，2001），該方法集試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模為一體，通過建立預(yù)測模型，并對模型適應(yīng)性、系數(shù)顯著性及失擬項進(jìn)行診斷和檢驗，可高效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件，從而達(dá)到優(yōu)化微生物發(fā)酵工藝、提高生產(chǎn)效益的目的（Ratnam et al.， 2003；Trupkin et al.， 2003）。本研究采用該方法優(yōu)化D2菌株發(fā)酵條件后，有效活菌數(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)酵的301倍，說明響應(yīng)面法對鏈霉菌D2菌株有較好的優(yōu)化效果。同時，利用該方法中的回歸模型推算出的理論活菌數(shù)與優(yōu)化發(fā)酵條件的實際有效活菌數(shù)基本一致，分別為3.01×108和2.99×108 CFU/mL。多個采用該方法優(yōu)化鏈霉菌發(fā)酵條件的研究也發(fā)現(xiàn)理論活菌數(shù)與實際發(fā)酵活菌數(shù)高度一致（高先軍，2010；燕照玲等，2014；李莉等，2015）。響應(yīng)面法還廣泛應(yīng)用于多種桿菌的發(fā)酵條件研究，如優(yōu)化馬紅球菌發(fā)酵培養(yǎng)基后顯著提高了馬紅球菌膽固醇的降解率（蔣丹丹等，2008），并大幅提高大腸桿菌生產(chǎn)干擾素的能力（Hernández et al.， 2008）；芮廣虎等（2012）采用Box-Behnken響應(yīng)面法對FM4B菌株進(jìn)行優(yōu)化后，其抑菌圈面積擴(kuò)大42%。

本研究僅對D2菌株發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，但對于發(fā)酵液的活性成分及抑菌機(jī)理尚不清楚，因此，后續(xù)研究有必要對發(fā)酵液的結(jié)構(gòu)組成及抑菌機(jī)理進(jìn)行重點分析，以期為甜瓜枯萎病生物防治的實踐及推廣提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的D2菌株發(fā)酵條件可有效提高該菌株的有效活菌數(shù)，且回歸模型推算出的理論活菌數(shù)與優(yōu)化條件發(fā)酵的有效活菌數(shù)接近，可用于指導(dǎo)D2菌株的實際規(guī)?；a(chǎn)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）