劉興斌　雒懷宇　閔聰　張宗申

摘要： 毛狀根的構型是影響其生長速度和生物量積累的重要因素，為了規(guī)?；囵B(yǎng)金鐵鎖毛狀根，進一步解決金鐵鎖資源短缺問題，該研究以金鐵鎖毛狀根為材料，通過改變培養(yǎng)基類型、碳源及碳源濃度，觀察和分析了毛狀根的生長狀態(tài)，找出影響毛狀根構型的因素。結果表明：最適合金鐵鎖毛狀根生長的培養(yǎng)基為B5+蔗糖30 g·L-1，金鐵鎖毛狀根主根長而粗壯，一級、二級側根生長量大，根系表面積較大，生長效果最佳。經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)驗證，測定毛狀根的生長量，與在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的毛狀根生長狀態(tài)基本一致。通過該項研究，優(yōu)化了培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的配比，實現(xiàn)了金鐵鎖毛狀根的快速生長和生物量的積累。

關鍵詞： 金鐵鎖， 毛狀根， 培養(yǎng)基類型， 碳源， 碳源濃度， 液體懸浮培養(yǎng)

中圖分類號： Q943.1文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2018）07-0859-07

Abstract： The configuration of hairy roots is an important factor affecting its growth rate and biomass accumulation. In order to cultivate the hairy root of Psammosilene tunicoides in a large scale and to solve the problem of its resource shortage， hairy roots of Psammosilene tunicoides were sampled for exploring the effects of medium types， carbon source and carbon concentration on the growth of hairy roots. The results showed that the most suitable medium for growth of hairy roots was B5 + 30 g·L-1 sucrose. Hairy roots are long， thick and strong， with large amount of the first and the second lateral roots and larger root surface area. Further examination was carried out in the mode of liquid suspension culture， and gained the similar conclusion with that of solid culture mode for the index of biomass of hairy roots. In this study， optimization of factors in the culture media facilitated the rapid growth and biomass accumulation of hairy roots.

Key words： Psammosilene tunicoides， hairy roots， medium types， carbon source， carbon source concentration， liquid suspension culture

金鐵鎖（Psammosilene tunicoides）是石竹科金鐵鎖屬單種屬植物，主要分布于我國西南地區(qū)（趙爽等，2012）。金鐵鎖的干燥根能祛風除濕、散瘀止痛、解毒消腫，是我國中成藥保密品種“云南白藥”的重要成分之一，為《中國植物紅皮書》中的國家二級重點保護的珍稀瀕危物種（李景濱等，2011）。金鐵鎖的主要化學成分是三萜類皂苷、環(huán)肽以及內(nèi)酰胺等（金虹和譚克勤，2005）。由于金鐵鎖野生資源破壞嚴重，且醫(yī)藥臨床需要急劇增加，利用毛狀根培養(yǎng)技術（Zhang et al，2014）定向培養(yǎng)，是獲取金鐵鎖天然活性產(chǎn)物的一種有效手段。毛狀根，又稱發(fā)狀根、發(fā)根，是將發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）中Ri質粒含有的T-DNA整合到植物細胞的DNA上，產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象（陳岺曦和王伯初，2007）。體外培養(yǎng)中，毛狀根具有生長速率快、高度分叉、激素自養(yǎng)等特點，是生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物非常理想的培養(yǎng)物（韓昱姝等，2014）。

毛狀根生長速度與其空間構型（側根分布）、營養(yǎng)供給、培養(yǎng)技術等因素有關。目前有關毛狀根空間構型建成機理的研究文獻相對較少，對于根構型建成的結果主要來自擬南芥、玉米、小麥、番茄、胡蘿卜、洋蔥、豆類等普通植物根系發(fā)育模型的研究。側根分布和向地性生長是決定根構型的主要因素，由參與調(diào)節(jié)根生長方向、動力學、根毛、側根頻率等參數(shù)的環(huán)境信號及其它信息決定的。其中側根是決定根構型的最關鍵因素之一。側根的發(fā)生首先在主根的中柱鞘細胞啟動，細胞經(jīng)過分裂、分化形成側根原基，然后繼續(xù)發(fā)育并突破表皮形成側根（王樹才等，2003）。研究表明，養(yǎng)分對側根構型具有一定的影響。植物能感受生長介質中N、Pi、S和Fe等養(yǎng)分的有效性并形成可識別的信號，從而調(diào)節(jié)植物細胞分裂和分化，影響根毛形成、主根生長和側根發(fā)育（López-Bucio et al，2002，2003）。本研究通過改變培養(yǎng)基類型、碳源及碳源濃度，觀察金鐵鎖毛狀根的生長狀態(tài)，測定毛狀根的生物量，從而優(yōu)化培養(yǎng)條件，建成毛狀根空間構型，為金鐵鎖毛狀根規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎，進一步解決金鐵鎖資源短缺問題。

1材料與方法

1.1 材料

金鐵鎖毛狀根，來自大連工業(yè)大學珍稀瀕危藥用植物細胞工程實驗室。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基類型的篩選從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于5種直徑90 mm的平板培養(yǎng)基中，內(nèi)裝MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6固體培養(yǎng)基，pH6.0，每個平板中接入毛狀根鮮重為0.3 g，每種培養(yǎng)基3個平行樣，25 ℃下暗培養(yǎng)。觀察毛狀根在培養(yǎng)5、15、28 d后生長狀態(tài)及構型。

1.2.2 碳源的篩選以B5固體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加同量的蔗糖、乳糖和葡萄糖，作為毛狀根生長的碳源，從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于3種直徑90 mm的平板培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件同1.2.1。觀察毛狀根在培養(yǎng)5、15、28 d后生長狀態(tài)及構型。

1.2.3 碳源濃度的篩選以B5固體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以蔗糖作為毛狀根生長的碳源，從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于6種直徑90 mm的平板培養(yǎng)基中，內(nèi)裝碳源濃度分別為0、20、30、40、60、80 g·L-1，其他培養(yǎng)條件同1.2.1。觀察毛狀根在培養(yǎng)5、15、28 d后生長狀態(tài)及構型，同時測定毛狀根主根直徑與側根間距。

1.2.4 金鐵鎖毛狀根的構型如圖1所示，金鐵鎖毛狀根呈現(xiàn)多級化，主根粗壯，直徑大，根系較長；一級側根分枝角度40°～70°之間，根系在更大范圍內(nèi)擴展且密度較大；二級根較短但密度大，根系表面積大，從而間接地反映了根系的生物量較大。

1.2.5 液體懸浮培養(yǎng)營養(yǎng)條件優(yōu)化從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于5種250 mL的錐形瓶培養(yǎng)基中，內(nèi)裝MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6液體培養(yǎng)基100 mL，pH6.0，每個瓶中接入毛狀根鮮重為0.5 g，每種培養(yǎng)基3個平行樣，25 ℃下暗培養(yǎng)，搖床轉數(shù)110 r·min-1。培養(yǎng)18 d后，觀察毛狀根生長狀態(tài)及構型，測定毛狀根生物量。

以B5液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加同量的蔗糖、乳糖和葡萄糖三種糖，作為毛狀根生長的碳源，從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于3種250 mL的錐形瓶培養(yǎng)基中，pH6.0，每個錐形瓶中接入毛狀根鮮重為0.5 g，每種培養(yǎng)基3個平行樣，25 ℃下暗培養(yǎng)，搖床轉數(shù)110 r·min-1。培養(yǎng)18 d后，觀察毛狀根生長狀態(tài)及構型，測定毛狀根生物量。

以B5液體培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，以蔗糖作為毛狀根生長的碳源，從優(yōu)良株系中剪取毛狀根根尖分別接種于6種250 mL的錐形瓶培養(yǎng)基中，內(nèi)裝碳源濃度分別為0、20、30、40、60、80 g·L-1，pH6.0，每個錐形瓶中接入毛狀根鮮重為0.5 g，每種培養(yǎng)基3個平行樣，25 ℃下暗培養(yǎng)，搖床轉數(shù)110 r·min-1。培養(yǎng)18 d后，觀察毛狀根生長狀態(tài)及構型，測定毛狀根生物量。

1.2.6 金鐵鎖毛狀根增長率的計算將液體懸浮培養(yǎng)18 d的毛狀根冷凍干燥，經(jīng)萬分之一電子天平稱量干重，計算毛狀根增長率。計算公式：

增長率 = （收獲干重-接種干重） /接種干重。

2結果與分析

2.1 培養(yǎng)基類型對毛狀根構型的影響

由圖2可知，MS、1/2 MS、1/2 B5、B5、N6 5種固體培養(yǎng)基對金鐵鎖毛狀根構型的影響。毛狀根在各固體培養(yǎng)基中整體向四周延伸生長，但根系長度、直徑、疏密等存在較大差異。B5培養(yǎng)基中的毛狀根生長速度最快，主根粗壯，直徑較大，一級、二級側根多而長，根系表面積較大，幾乎鋪滿整個平板。1/2 B5培養(yǎng)基中的毛狀根生長狀態(tài)次之，根的絨毛多，但主根相對較細。MS和1/2 MS培養(yǎng)基中的毛狀根生長狀態(tài)基本相近，主根少而短，一級、二級側根比較稀疏，根系表面積相對較小。N6培養(yǎng)基中的毛狀根生長緩慢，主根、一級、二級側根均較少，整體呈現(xiàn)老化態(tài)勢。

2.2 碳源對毛狀根構型的影響

由圖3可知，分別添加30 g·L-1的蔗糖、乳糖和葡萄糖的B5固體培養(yǎng)基對金鐵鎖毛狀根構型的影響。在25 ℃條件下培養(yǎng)28 d后，添加蔗糖的培養(yǎng)基中毛狀根主根長而粗壯，一級側根密集且表面有大量絨毛，進一步發(fā)育成二級側根，根系表面積大。添加乳糖的培養(yǎng)基中毛狀根主根少且短，一級側根極少，基本不生長。添加葡萄糖的培養(yǎng)基中毛狀根主根稀疏，側根較短且呈現(xiàn)畸態(tài)。

2.3 蔗糖濃度對毛狀根的構型影響

由圖4和表1可知，在25 ℃條件下培養(yǎng)28 d后，蔗糖濃度為0 g·L-1時，毛狀根基本不生長，僅有少量主根，直徑僅為（0.322 2±0.009 4）mm，一級側根較為稀疏，側根間距為（5.485 9±0.361 4）mm。隨著蔗糖濃度的增大，毛狀根主根發(fā)達，一級、二級側根密集，當蔗糖濃度為30 g·L-1時，毛狀根生長狀態(tài)最佳，主根直徑達到（0.763 6±0.010 4）mm，側根間距為（2.105 1±0.236 6）mm，根系表面積達到最大。隨著蔗糖濃度繼續(xù)增大，毛狀根主根開始減少且長度變短，一級、二級側根也相對減少。蔗糖濃度達到80 g·L-1時，主根直徑為（0.539 6±0.006 1）mm，側根間距為（2.105 1±0.236 6）mm，生長受到抑制。

2.4 液體懸浮培養(yǎng)營養(yǎng)條件對毛狀根的構型影響

從圖5可以看出，經(jīng)液體懸浮培養(yǎng)18 d，B5培養(yǎng)基中的毛狀根主根粗壯且生長出大量一級、二級側根，生長量最大，其增長率為（12.95±0.35）%。但B5培養(yǎng)基中毛狀根由于生長速度較快，培養(yǎng)時間過長，逐漸老化。N6培養(yǎng)基中毛狀根主根較少，側根較細，生長量最小。液體懸浮培養(yǎng)過程中，金鐵鎖毛狀根對蔗糖的利用率最高， 生長量隨蔗糖濃度的增加，呈先升后降的趨勢。當蔗糖濃度為0 g·L-1時，毛狀根生長量最小；當蔗糖濃度為30 g·L-1時，毛狀根生長量最大，增長率為（13.89±0.33）%，分支多而粗壯；隨著蔗糖濃度繼續(xù)增大，毛狀根生長量逐漸降低，毛狀根生長受到抑制。

3討論與結論

3.1 培養(yǎng)基的選擇

本研究中，不同培養(yǎng)基所含營養(yǎng)物質的成分及比例不同，但培養(yǎng)基中適當?shù)臓I養(yǎng)物質濃度對毛狀根的生長具有促進作用，過低或者過高均會對其生長產(chǎn)生一定的限制作用。Bensaddek et al（2001）以顛茄毛狀根為材料研究硝酸鹽和銨鹽濃度的作用，結果發(fā)現(xiàn)氨態(tài)氮的升高會導致毛狀根生長量降低。高帥等（2012）的研究表明，毛狀根在B5培養(yǎng)基中生長狀態(tài)最好，干重增加了15.8倍，隨著硝態(tài)氮含量的降低，毛狀根的生長量也逐漸降低，推測硝態(tài)氮是影響毛狀根生長的主要元素之一。此外，Mg2+是影響毛狀根生長的另一重要元素。在研究營養(yǎng)元素對丹參毛狀根生長的影響時發(fā)現(xiàn)，提高大量元素 MgSO4·7H2O含量，能促進丹參毛狀根的生長（沈雙等，2011）。本研究中，B5培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮、MgSO4·7H2O含量均最高，氨態(tài)氮含量較低，毛狀根主根粗壯，一級、二級側根密集且長，生長能力極強，與前人的研究結果相似。劉軍等（2013）的研究發(fā)現(xiàn)，在1/2 MS培養(yǎng)基上生長的毛狀根各方面性質都較好，在B5培養(yǎng)基中生長速度快，但容易褐化，MS培養(yǎng)基中的毛狀根也會有一定褐化，N6和1/4 MS培養(yǎng)基的毛狀根生長速度較慢?？梢?，金鐵鎖毛狀根在液體和固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求是有差異的。

3.2 碳源及碳源濃度的選擇

碳源為毛狀根的生長提供了物質基礎，但不同的碳源對毛狀根構型具有不同的影響。本研究結果表明，以蔗糖作為碳源，金鐵鎖毛狀根，側根較多，生物量最大；以葡萄糖、果糖作為碳源，毛狀根生長速度下降，出現(xiàn)褐變現(xiàn)象；而以乳糖、麥芽糖、淀粉為碳源，毛狀根分枝急劇減少，生長受到抑制。金鐵鎖毛狀根利用蔗糖的能力最強，有利于毛狀根的生長（田思迪等，2012）。在水母雪蓮毛狀根和南美蟛蜞菊毛狀根的研究中均發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖作為碳源更有利于毛狀根的生長（楊睿等，2005；歐少云等，2010）。這與本研究的結果有差異，可能與實驗中所用植物材料有關， 不同植物對于碳源的吸收和利用效率具有明顯的不同。本研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度是影響毛狀根構型的又一重要因素。假酸漿毛狀根生長速度隨著MS液體培養(yǎng)基中蔗糖濃度的升高，其增殖量呈現(xiàn)先增后降的現(xiàn)象（馬玲等，2013）。寧凝和楊世海（2013）在研究培養(yǎng)因子對黃秋葵毛狀根生長影響時發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度為3%時，對黃秋葵毛狀根的促進作用最強，增殖倍數(shù)最高。本研究中，毛狀根生長量隨著蔗糖濃度的增大而逐漸增大；當蔗糖濃度為30 g·L-1時，毛狀根主根粗壯，直徑較大，產(chǎn)生大量的一級、二級側根，根系表面積較大，生長量達到最大；當蔗糖濃度繼續(xù)增加時，毛狀根生長受到抑制，這些結果與前人的研究結論基本一致。

總之，通過改變培養(yǎng)基類型、碳源及碳源濃度及優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以促進金鐵鎖毛狀根的生長，實現(xiàn)毛狀根主根長且粗壯、一級和二級側根密集、根系表面積較大等較理想的毛狀根表型，對后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)提供了重要的基礎數(shù)據(jù)。

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