李同建 董婧 廖亮 金洪光 韓興杰 文鋒 徐玲玲

摘 要： 為了獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的微衛(wèi)星分子標(biāo)記，該研究采用磁珠富集法構(gòu)建了三葉木通微衛(wèi)星富集文庫。結(jié)果表明：在150個(gè)陽性克隆中發(fā)現(xiàn)了70個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，富集效率為46.67%，其中含雙堿基重復(fù)單元的序列占比為79.37%，三堿基和四堿基重復(fù)含有量較少。共設(shè)計(jì)引物63對(duì)，其中篩選出16對(duì)高多態(tài)引物，對(duì)1個(gè)三葉木通自然居群48個(gè)個(gè)體進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果顯示位點(diǎn)的等位基因數(shù)為10～22個(gè)，觀察雜合度和期望雜合度分別為0.370～0.792和0.724～0.936，多態(tài)性信息指數(shù)為0.725～0.919，表明以上引物均為高多態(tài)性引物。其中，12個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡，呈現(xiàn)出純合子過剩狀態(tài)，這可能與啞等位基因和其它因素有關(guān)。綜上結(jié)果表明，該研究所開發(fā)的16對(duì)引物能夠用于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)工作。

關(guān)鍵詞： 三葉木通， 微衛(wèi)星分子標(biāo)記， 磁珠富集法

中圖分類號(hào)： Q943.2， Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1117-08

Abstract： Akebia trifoliata is perennial， woody vine producing large edible fruits. The high medicinal and nutritional values of A. trifoliata make it worthy of being exploited as a new crop. Wild resources of these species have been se-riously deteriorated due to years of disorder planting and over-harvesting， thus wild germplasm resources protection and evaluation are particularly important. In order to obtain suitable molecular markers for genetic structure and genetic diversity of the existing resources， enriched SSR library was established using the magnetic bead enrichment procedure. Seventy SSR loci were obtained in 150 positive clones， and enrichment efficiency was 46.67%. Thereinto， sequences with two-base repeat unit accounted for 79.37%， far more than sequences with three-base and four-base. Sixteen pairs of high polymorphic primers were chosen in sixty-three pairs primers and characterized by 48 individuals collected in Lushan. The allele numbers per locus ranged from 10 to 22， and the observed and expected heterozygosity ranged from 0.370 to 0.792 and from 0.724 to 0.936， respectively， polymorphisms information content ranged from 0.725 to 0.919， which showed that the above primers were high polymorphic primers. Twelve pairs of primers deviated from Hardy-Weinberg equilibrium， showing excess of homozygotes， which might be related to null genes and other reasons. These molecular markers will contribute to evaluation on genetic diversity and population structure， lay a foundation for conservation and evaluation of A. trifoliata genetic resource.

Key words： Akebia trifoliata， microsatellite marker， magnetic bead enrichment

三葉木通（Akebia trifoliata）是木通科（Lardizabalaceae）木通屬（Akebia Decne.）的一種半落葉木質(zhì)藤本纏繞植物，分布于秦嶺以南至南嶺，西至云南，東至浙閩16個(gè)省廣大亞熱帶地區(qū)（萬明長(zhǎng)等， 2008）。其種下劃分為三葉木通（A. trifoliata subsp. trifoliata）、白木通（A. trifoliata subsp. australis）、長(zhǎng)萼三葉木通（A. trifoliata subsp. longisepala） 3亞種（中國(guó)植物志編輯委員會(huì)， 2001）。木通屬植物具有利尿、鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)濕的功效，作為中藥有兩千多年的歷史（馮航， 2010； 李麗等， 2010； 李麗， 2010）。近期研究表明，其還具有抗衰老、提高免疫功能、抑制腫瘤等功效（An et al， 2016）。木通屬植物果實(shí)較大，果肉甜糯，具有極高開發(fā)價(jià)值，在湖南、江西、貴州等地已有農(nóng)戶開始種植（羅克明等， 2008）。其種子含油量達(dá)40%，具有較高的食用價(jià)值（仲偉敏和馬玉華， 2016）。與其高開發(fā)價(jià)值不匹配的是三葉木通種質(zhì)資源研究較晚，大規(guī)模無序的種植、開發(fā)對(duì)野生種質(zhì)資源造成巨大威脅。因此，有必要深入研究三葉木通種質(zhì)資源，利用現(xiàn)代育種技術(shù)培育栽培品種，為三葉木通資源的可持續(xù)利用和種植產(chǎn)業(yè)起步打下基礎(chǔ)。九江學(xué)院在中國(guó)、日本和韓國(guó)已搜集70余個(gè)不同產(chǎn)地的野生三葉木通資源，建設(shè)了三葉木通種質(zhì)資源圃。但是，由于三葉木通分子生物學(xué)研究起步較晚，GenBank中僅能檢索到440余條DNA序列，可用的分子標(biāo)記較少，嚴(yán)重阻礙了資源的評(píng)價(jià)工作，因此急需開發(fā)合適的分子標(biāo)記對(duì)現(xiàn)有資源進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性評(píng)價(jià)（Li et al， 2009； Sun et al， 2016； 黃佩蓓等， 2016）。

微衛(wèi)星分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好、條帶少易識(shí)別等諸多優(yōu)點(diǎn)，是目前遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究中的首選標(biāo)記之一（Grover & Sharma， 2016），隨著熒光毛細(xì)管電泳技術(shù)在微衛(wèi)星檢測(cè)中的應(yīng)用，微衛(wèi)星標(biāo)記變得更加高效和廉價(jià)（Wenz et al， 1998）。本研究擬采用 三葉木通微衛(wèi)星分子標(biāo)記，并利用7個(gè)不同產(chǎn)地的三葉木通個(gè)體和1個(gè)三葉木通自然居群檢測(cè)引物的穩(wěn)定性和多態(tài)性，以期獲得適于三葉木通遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究的微衛(wèi)星分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料采集 在人工種植基地采集栽培三葉木通個(gè)體7個(gè)，用于檢測(cè)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增穩(wěn)定性和多態(tài)性。在九江廬山采集三葉木通自然居群1個(gè)（n=48），用于微衛(wèi)星文庫建立和后期引物評(píng)價(jià)（表1）。采集每個(gè)個(gè)體新鮮、健康的幼嫩葉片放入裝有變色硅膠的自封袋中迅速干燥，置于-20 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。憑證標(biāo)本保存于九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究室。

1.1.2 試劑 10×PCR buffer、25 mmol·L-1 MgCl2、dNTPs、DNA Taq聚合酶（5 U·μL-1）均購自上海生工生物（Sangon Biology）工程有限公司；限制性內(nèi)切酶Rsa I（10 U·μL-1）、BstU I（10 U·μL-1）、Xmn I（20 U·μL-1）購自New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase（400 U·μL-1）購自Promega公司； DNA Marker購自大連Takara公司； 接頭引物SuperSNX24-F （5′-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGCAGAATC）和Super-SNX24-R （5′-GATTCTGCTAGCTAGGCCTTAAACAAAA）由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 已干燥的三葉木通樣本采用改良的CTAB法提取總DNA（Doyle & Doyle， 1987），并利用PEG8000純化，詳細(xì)步驟為將40% PEG8000與5 mol·L-1 NaCl按1∶1比例配置成工作液，與等比例的DNA溶液混合，搖勻并置于37 ℃下靜置15 min，12 000 r·min-1離心16 min，沉淀再由80%乙醇清洗2次，烘干。TE溶解后用Nanodrop檢測(cè)合格后，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 酶切與接頭連接 使用限制性內(nèi)切酶Rsa I或BstU I和Xmn I組合對(duì)三葉木通基因組DNA進(jìn)行酶切，于37 ℃溫浴過夜。酶切體系為25 μL：2.5 μL 10×T4 ligase buffer（NEB4），0.25 μL 100×BSA，0.25 μL 5 mol·L-1 NaCl，1.0 μL 10 U·μL-1 Rsa I/BstU I，1.0 μL 20 U·μL-1 Xmn I，20 μL 200 ng·μL-1 DNA。取1 μL酶切產(chǎn)物先用1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)酶切片段是否位于200～800 bp范圍內(nèi)；然后將SuperSNX24-F和SuperSNX24-R合成接頭置于水浴鍋中95 ℃反應(yīng)5 min，緩慢冷卻至室溫；最后將制備好的接頭與酶切產(chǎn)物連接。反應(yīng)體系如下：7 μL接頭，2.5 μL NEB 10×T4 ligase buffer，2.0 μL 350 U·μL-1 T4 ligase，13 μL酶切產(chǎn)物，加雙蒸水至25 μL，16 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物作為模板，利用SuperSNX24-F接頭作為引物通過PCR擴(kuò)增檢測(cè)連接結(jié)果。反應(yīng)體系如下：2.5 μL 10×PCR buffer，0.13 μL 100 μmol·L-1 SuperSNX24-F，1.5 μL 2 mmol·L-1 dNTP，2.0 μL 25 mmol·L-1 MgCl2，2.5 μL BSA，0.2 μL 連接產(chǎn)物DNA，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)24次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 雜交與磁珠富集 微衛(wèi)星富集采用Glenn & Schable（2005）的方法，將連接產(chǎn)物與帶生物素的探針混合物（AG）12、（CG）12、（AT）12、（GT）12、（ACT）12、（AAGT）8、（AACT）8、（AGAT）8進(jìn)行雜交。雜交反應(yīng)體系：25 μL 2×Hyb Solution，10 μL 10 μmol·L-1生物素標(biāo)記的探針，10 μL連接產(chǎn)物，加雙蒸水至50 μL。雜交反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；70 ℃開始，每個(gè)循環(huán)降低0.2 ℃，維持5 s，循環(huán)99次；50 ℃保持5 min；每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃，保持5 s，循環(huán)20次；15 ℃保持。用鏈霉素親和磁珠（Promega Magne Sphere）捕獲結(jié)合了生物素探針的DNA片段，用洗脫液洗脫未結(jié)合的探針。具體操作如下：250 μL TE 洗滌50 μL混勻的磁珠2次，50 μL 1×Hyb Solution平衡磁珠2次；將DNA和生物素探針混合物的雜交體系加入到磁珠中，于16 ℃下150 r·min-1振蕩約1 h雜交；加入400 μL Wash Solution I洗脫2次，且第一次加入400 μL Wash Solution Ⅱ于45～48 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次，再次加入400 μL Wash Solution Ⅱ混勻，于50～53 ℃下水浴振蕩2 min洗脫2次。加入200 μL TE于95 ℃下水浴5 min徹底洗脫富集DNA，向上清液中加入22 μL 3 mol·L-1醋酸鈉和445 μL預(yù)冷的無水乙醇，沉淀DNA。用80%乙醇洗滌，離心烘干后加入20 μL TE溶解。用接頭SuperSNX24-F作為引物對(duì)富集產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增回收，PCR反應(yīng)體系和程序與檢測(cè)時(shí)相同。為增加富集的陽性率，重復(fù)以上步驟1次，進(jìn)行2次富集，用PEG8000法純化DNA。

1.2.4 克隆與陽性篩選 將純化后的富集產(chǎn)物克隆到pEGM-T載體中，連接反應(yīng)在PCR儀上16 ℃過夜，將重組子轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)24 h。每板挑取50～100個(gè)白色單菌落，在另一含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，并接種于菌落PCR反應(yīng)液中，通過菌落PCR（M13F和M13R為引物）篩選出陽性克隆，把劃線的平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。取3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其是否為含有目的片段的陽性菌落。選擇PCR檢測(cè)為陽性的菌落接種至500 μL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，將培養(yǎng)菌液送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 序列分析與引物設(shè)計(jì) 首先，將測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入Geneious 4.8軟件中進(jìn)行檢測(cè)，使用Trim-ends和Search for the motifs工具去除載體和接頭序列，對(duì)有疊峰的序列進(jìn)行反向測(cè)序。然后，將經(jīng)過處理的序列通過Tandem Repeats Finder version 4確定SSR位點(diǎn)，并分析位點(diǎn)的堿基重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)、查看序列長(zhǎng)度及微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端側(cè)翼序列是否符合引物設(shè)計(jì)的要求（Benson， 1999）。使用Geneious 4.8內(nèi)嵌的引物設(shè)計(jì)功能進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)引物送于上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成。

1.2.6 引物穩(wěn)定性、多態(tài)性篩選及評(píng)價(jià) 為了篩選擴(kuò)增穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的引物和其最佳PCR條件，我們用設(shè)計(jì)的引物對(duì)7個(gè)不同地區(qū)采集的三葉木通進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

將篩選出的高多態(tài)性SSR引物合成5′端熒光標(biāo)記引物，其熒光基團(tuán)為FAM（藍(lán)色），HEX（綠色）。選取采集于九江廬山的48個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送往北京閱微基因有限公司使用ABI3730遺傳分析儀進(jìn)行STR分型，內(nèi)標(biāo)均為ROX500。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 首先，使用Genemapper 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過Micro-Checker 2.2.3檢測(cè)啞等位基因（Van Oosterhout et al， 2004）。然后，用Genalex 6.5（Peakall & Smouse， 2010） 計(jì)算出每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、 有效等位基因數(shù) （effective number of alleles，Ne）、觀察雜合度（observed heterozygosity，Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity，He）及哈迪-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）。最后，使用PowerMaker （Liu & Muse， 2005）計(jì)算多態(tài)性信息指數(shù)（polymorphic information content，PIC）和連鎖遺傳不平衡（linkage disequilibrium， LD）。所有P值均經(jīng)Bonferroni法校正。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星富集

選擇2個(gè)限制性內(nèi)切酶組合（Rsa I和Xmn I、BstU I和Xmn I）對(duì)三葉木通基因組進(jìn)行酶切，Rsa I和Xmn I的組合酶切后基因組小片段電泳條帶彌散，大小分布在100～1 500 bp之間，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的連接和雜交富集打好基礎(chǔ)。BstU I和Xmn I的組合酶切片段較長(zhǎng)，片段長(zhǎng)度集中在100～200 bp、300～500 bp及大于1 500 bp，這些酶切產(chǎn)物不利于后續(xù)磁珠富集操作。本研究用金屬浴加熱進(jìn)行漂洗，先在16 ℃下用Washing Solution I漂洗1次；再用Washing Solution Ⅱ分別在45 ℃和50 ℃下漂洗2次，結(jié)果富集率太低。然后調(diào)整漂洗溫度，用Washing Solution Ⅱ分別在46 ℃和51 ℃下漂洗2次，獲得所需目的片段，且大大提高了陽性克隆率。

共挑取230個(gè)陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)，大小在300～1 000 bp之間，其中約有40個(gè)未擴(kuò)增出目的片段，部分菌落空載。在190個(gè)陽性克隆中挑選出片段長(zhǎng)度不同的150個(gè)單菌落送往公司測(cè)序，148個(gè)測(cè)序成功。其中，70個(gè)含有微衛(wèi)星序列，富集率為46.67%；可設(shè)計(jì)引物的序列有57條，占SSR序列的81.43%。57條可設(shè)計(jì)引物的序列共設(shè)計(jì)引物63對(duì)，其中含雙堿基重復(fù)單元的序列占SSR序列的79.37%，高于三堿基重復(fù)單元的序列占SSR序列的20.63%。

2.2 引物篩選與分析

54對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小在100～300 bp之間。先用7個(gè)DNA樣本為模板初次篩選出條帶清晰、有多態(tài)性的引物33對(duì)；再用48個(gè)DNA樣本為模板進(jìn)一步對(duì)33對(duì)引物進(jìn)行篩選，選出條帶清晰、非特異性條帶少、多態(tài)性較高及擴(kuò)增效率穩(wěn)定的引物16對(duì)，可以用于SSR位點(diǎn)分析。

48個(gè)樣品的三葉木通居群中共檢測(cè)到220個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為10～22個(gè)，平均等位基因數(shù)為15.938個(gè)，觀察雜合度為0.370～0.792，期望雜合度為0.724～0.936，多態(tài)性信息指數(shù)為0.725～0.919（均值為0.861），其中12個(gè)位點(diǎn)經(jīng)Bonferroni校正后仍然偏離哈迪-溫伯格平衡，呈現(xiàn)純合子過剩狀態(tài)，檢測(cè)到14個(gè)位點(diǎn)存在大小不等的啞等位基因頻率。發(fā)現(xiàn)了3個(gè)引物對(duì)（MT33-MT45，MT15-MT56和MT35-MT62）存在連鎖不平衡（表2）。

3 討論與結(jié)論

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，使得SSR位點(diǎn)獲得更加低廉、高效，越來越多的研究利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行高效的微衛(wèi)星開發(fā)（萬冬梅等，2016）。在群體遺傳和進(jìn)化研究中需要的微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量較少，磁珠富集法可在1周內(nèi)完成微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建工作，其高效、快捷的特點(diǎn)更適合少量微衛(wèi)星引物的開發(fā)（王靜等， 2015）。在本研究中，因?qū)嶒?yàn)室熟練掌握了磁珠富集法，故選用該方法構(gòu)建三葉木通的微衛(wèi)星富集文庫，在148個(gè)成功測(cè)序的陽性克隆中獲得70個(gè)富含微衛(wèi)星的序列，富集效率較高，達(dá)到46.67%。雖然本研究使用了8種不同的探針，包括雙堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)和四堿基重復(fù)，但富集的微衛(wèi)星序列主要以雙堿基重復(fù)為主（79.37%），三堿基和四堿基重復(fù)含有量較少。開發(fā)的16對(duì)引物中僅有2對(duì)引物為三堿基重復(fù)（MT27，MT33）。這與前人報(bào)道的植物中微衛(wèi)星序列主要以雙堿基重復(fù)為主一致（Morgante & Olivieri， 1993）。

利用篩選到的16對(duì)引物對(duì)采自廬山的三葉木通居群進(jìn)行遺傳分析，共擴(kuò)增出220個(gè)多態(tài)性條帶，發(fā)現(xiàn)以上引物的平均等位基因數(shù)為15.938個(gè)，觀察雜合度為0.370～0.792，期望雜合度為0.724～0.936，這與李麗（2010）的研究結(jié)果相近。多態(tài)性信息指數(shù)（PIC）是評(píng)估微衛(wèi)星引物多態(tài)性水平的重要參數(shù)，普遍認(rèn)為PIC>0.5為高多態(tài)引物，0.25綜上所述，本研究開發(fā)的16對(duì)SSR多態(tài)性引物可用于三葉木通遺傳分析，進(jìn)一步補(bǔ)充和完善了木通微衛(wèi)星分子標(biāo)記工具，為三葉木通種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和開發(fā)等后續(xù)研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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