郭學(xué)武 張玉 關(guān)翔宇 倪曉豐 汪慶 陳葉福 肖冬光

（1 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

2，3-丁二醇是一種重要的化工原料，廣泛用于化工、食品、燃料以及航空航天等多個(gè)領(lǐng)域［1-4］。目前，2，3-丁二醇的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法兩種。其中生物法既符合綠色化工的要求，又可以克服化學(xué)法生產(chǎn)的困難，受到了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。

迄今為止，2，3-丁二醇生產(chǎn)效率最高的菌株主要 有 Klebsiella pneumoniae［5］、Klebsiella oxytoca［6］以及Bacillus polymyxa［7］等菌種。肺炎克雷伯氏菌是腸桿菌科中的一種兼性厭氧菌，其寬廣的底物利用范圍，尤其是其優(yōu)良的五碳糖利用能力，在木質(zhì)纖維素類物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化方面具有極大的應(yīng)用潛力［4，8］。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量?jī)H次于葡萄糖的一種單糖，因此，充分利用纖維素原料中的木糖、提高木糖 2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率是高效利用纖維素原料生產(chǎn) 2，3-丁二醇的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前，對(duì)2，3-丁二醇發(fā)酵的研究主要以葡萄糖為原料，并取得了較好的成果［5，9］。以木糖為底物發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇的研究始于20世紀(jì)80年代初［10-11］，但近年研究較少，且主要是葡萄糖和木糖混合發(fā)酵［12］。Yan等［13］指出，玉米秸稈酶法水解獲得的水解液中，葡萄糖和木糖的比例約為2∶1（W/W），而如果只有葡萄糖能夠被利用，木質(zhì)纖維素的利用率僅有約30%［14］，在此前提下，將木糖進(jìn)行有效利用，能將木質(zhì)纖維素的利用率提高至50%以上［15］，因此，找到一種可行的方法對(duì)木糖加以利用，能夠有效提高木質(zhì)纖維素的利用率，提高生產(chǎn)效率，降低成本。而在已經(jīng)報(bào)道的利用木糖生產(chǎn)2，3-丁二醇的研究中，無(wú)論是產(chǎn)2，3-丁二醇的質(zhì)量濃度還是轉(zhuǎn)化率都不理想，尚無(wú)大規(guī)模生產(chǎn)的報(bào)道［16-20］。

菌種在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，尤其是菌株對(duì)原料或產(chǎn)物及有毒副產(chǎn)物的耐受性。肺炎克雷伯氏菌是目前已知存在的天然 2，3-丁二醇產(chǎn)量最高的菌株之一，前人對(duì)該菌株生產(chǎn) 2，3-丁二醇的研究大都集中在不同底物和條件下表型優(yōu)異菌株的篩選和發(fā)酵條件的優(yōu)化以及少數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)上，對(duì)該菌株木糖耐受性的研究一直沒(méi)有突破。微生物在不同環(huán)境脅迫下的耐受性對(duì)生物燃料和生物化學(xué)產(chǎn)品的高效生產(chǎn)具有重要意義，這些性狀的改善往往是通過(guò)進(jìn)化工程方法包括誘變劑誘變和連續(xù)傳代。本研究通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法以肺炎克雷伯氏菌株（KPG）為出發(fā)菌株，通過(guò)反復(fù)壓力誘導(dǎo)和篩選不斷提高菌株對(duì)木糖的耐受性，獲得了高木糖耐性和高產(chǎn)2，3-丁二醇的突變株。同時(shí)，對(duì)突變株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并通過(guò)響應(yīng)面的方法優(yōu)化了發(fā)酵條件，旨在提高2，3-丁二醇的產(chǎn)量，為2，3-丁二醇的生物轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 肺炎克雷伯氏菌（K. pneuoniae CICC 10781），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）；蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，121℃滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基需添加瓊脂1.5%。種子培養(yǎng)基（g/L）：碳源：木糖20.0，其它：酵母浸粉10.0，KH2PO46.0，K2HPO414.0，（NH4）2SO42.0，檸檬酸鈉 4.0，乙酸鈉 4.0，MgSO4·7H2O 0.4，pH 6.0。木糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：碳源：木糖120，其它：酵母浸粉10.0，KH2PO46.0，K2HPO414.0，（NH4）2SO42.0，檸檬酸鈉 4.0，乙酸鈉 4.0，MgSO4·7H2O 0.4，pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 適應(yīng)性進(jìn)化的方法 KPG為出發(fā)菌株，在一定木糖濃度液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL菌液，離心洗滌后將獲得的菌體涂布于對(duì)應(yīng)木糖濃度的固體培養(yǎng)基上靜置培養(yǎng)過(guò)夜，然后挑取其中最大的幾個(gè)單菌落，再次在木糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如此循環(huán)往復(fù)，每72 h向培養(yǎng)基中多加入5 g/L的木糖，以120 g/L初始木糖濃度作為篩選條件，通過(guò)壓力篩選不斷提高菌體對(duì)木糖的耐受性。初步篩選結(jié)束后，對(duì)獲得的菌株利用濃度為120 g/L的木糖液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，定期取樣測(cè)定發(fā)酵液中木糖的濃度和2，3-丁二醇的產(chǎn)量。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法 由于親本菌株在發(fā)酵24 h以后基本不再耗糖，而通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化得到的突變株在24-48 h的耗糖速率與前24 h基本不變，如圖1所示，因此選擇在發(fā)酵24 h的菌株作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)試菌株樣品。

圖1 突變菌株KP2和親本菌株KPG的木糖消耗曲線

使用Illumina HiSeq 2000系統(tǒng)在提取總RNA后進(jìn)行mRNA選擇，文庫(kù)制備和測(cè)序，使用納米光度計(jì)（IMPLEN，USA），qubit 2.0熒光計(jì)（生命技術(shù)公司）和安捷倫2100 RNA Nano 6000檢測(cè)試劑盒（安捷倫，美國(guó)）評(píng)估m(xù)RNA樣品的質(zhì)量和數(shù)量。使用隨機(jī)六聚體引物從具有高樣品，高純度和高完整性的mRNA樣品中構(gòu)建cDNA文庫(kù)，在修飾和富集以連接到Illumina流動(dòng)池后，使用Illumina HiSeq 2000對(duì)得到的cDNA文庫(kù)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并且通過(guò)堿基調(diào)用將獲得的數(shù)據(jù)翻譯成原始數(shù)據(jù)。在序列組裝和注釋之前刪除了低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，這些低質(zhì)量數(shù)據(jù)包含適配器的一部分讀取，一部分不確定堿基的比例超過(guò)5%的讀取，其余的是質(zhì)量得分低于20分，其中20分相當(dāng)于1%的預(yù)期錯(cuò)誤率。由于沒(méi)有參考K.pneumonia CICC 10781基因組，因此選擇Trinity軟件包來(lái)組裝其轉(zhuǎn)錄組（k-mer 臨界值為25），去除冗余之后進(jìn)一步組裝成Unigenes，用Phrap進(jìn)行同源轉(zhuǎn)錄本聚類后，幾個(gè)基因的高度相似性構(gòu)成一個(gè)簇。選擇FPKM計(jì)算所有unigenes的表達(dá)量，并用SOAP（錯(cuò)誤率不超過(guò)0.01，多次差異超過(guò)2倍）顯示差異表達(dá)unigenes，獲得的差異表達(dá)unigenes向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.geneontology.org/）的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。

KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)unigenes中顯著性富集的Pathway。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 在1 L發(fā)酵罐中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基700 mL，以7%的接種量接入誘導(dǎo)突變后的肺炎克雷伯氏菌（KP2），發(fā)酵72 h，每隔一段時(shí)間取一次樣，不同通氣量（0.2 L/min、0.5 L/min、0.8 L/min、1.1 L/min），不同轉(zhuǎn)速（150 r/min、300 r/min、450 r/min），不同 pH 值（4、5.5、7）、不同溫度（30℃、35℃、40℃）條件下進(jìn)行木糖發(fā)酵的單因子影響試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵液中2，3-丁二醇濃度、細(xì)胞濃度、木糖殘留量以及副產(chǎn)物的濃度。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以2，3-丁二醇的產(chǎn)量為響應(yīng)值，選取對(duì)2，3-丁二醇的產(chǎn)量影響顯著的因素以及較好的水平區(qū)間，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理［22-23］，采用響應(yīng)面分析法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最優(yōu)發(fā)酵條件。發(fā)酵條件響應(yīng)面因素水平編碼表如表1所示。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，方差法分析處理數(shù)據(jù)。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 用響應(yīng)面優(yōu)化得到的發(fā)酵條件來(lái)發(fā)酵突變的肺炎克雷伯氏菌KP2，測(cè)得2，3-丁二醇的產(chǎn)量與未優(yōu)化的普通發(fā)酵條件所得的2，3-丁二醇產(chǎn)量進(jìn)行比較，驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化的效果。

1.2.6 分析方法 木糖殘留量、2，3-丁二醇濃度及副產(chǎn)物濃度的測(cè)定：采用高效液相色譜法［3］；肺炎克雷伯氏菌干重測(cè)定（DCW）：取樣，將發(fā)酵液稀釋10倍，在600 nm下檢測(cè)吸光度值，對(duì)照吸光度（OD600）和細(xì)胞干重（DCW）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到菌體干重。吸光度和細(xì)胞干重的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.467 2x-0.014 4，其中R2=0.99。2，3-丁二醇的得率為2，3-丁二醇生成量/木糖的消耗量（g/g）。

圖2 突變菌株KP2和親本菌株KPG在120g/L木糖濃度下生長(zhǎng)情況

圖3 比對(duì)到Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中E-value的分布

表2 突變菌株KP2和親本菌株KPG 2，3-丁二醇的生產(chǎn)

2 結(jié)果

2.1 適應(yīng)性進(jìn)化菌株的篩選

本次研究將親本肺炎克雷伯氏菌株對(duì)木糖耐受性閾值定為75 g/L，逐步提高木糖的濃度，以120 g/L初始木糖濃度作為篩選條件，通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法反復(fù)篩選，最終獲得了一株在120 g/L初始木糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率較快及生長(zhǎng)性能良好的菌株KP2，結(jié)果見(jiàn)圖2。所獲得菌株與親本菌株相比，木糖轉(zhuǎn)化率提高了174.5%，親本菌株產(chǎn)生的Meso-2，3-BD（內(nèi)消旋型2，3-丁二醇）和 L-2，3-BD（右旋型2，3-丁二醇）的產(chǎn)量分別為8.55 g/L和1.53 g/L，比例為5.6∶1，突變菌株分別為25.5 g/L和7.49 g/L，比例3.4∶1，2，3丁二醇的總體產(chǎn)量提高了227%（表2）。

2.2 高木糖耐性肺炎克雷伯氏菌轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 Unigene功能注釋 對(duì)KP2和KPG菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，獲得兩菌株轉(zhuǎn)錄本信息，共計(jì)Unigene 4 539個(gè)，總長(zhǎng)5 693 375 Nt，通過(guò)blastx將Unigene序列比對(duì)到蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG，并通過(guò)blastn將Unigene比對(duì)到核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Nt，得到該Unigene的蛋白功能注釋信息。結(jié)果顯示，Unigene注 釋 到 Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)目分別為3 920、3 496、3 283、3 414、3 309、3 299和3 990。比對(duì)到NCBI Nr數(shù)據(jù)庫(kù)的unigenes如圖3所示，其中33.4%的unigenes具有同源性，31.4%的unigenes具有較強(qiáng)的同源性，35.2%的unigenes具有非常強(qiáng)的同源性。

COG注釋的結(jié)果如圖4，按照基因功能分類，包含KPG和KP2兩個(gè)樣品的所有注釋Unigene種類最多的四個(gè)類群分別為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（E）、碳水化合物運(yùn)輸代謝（G）、常規(guī)功能基因（R）和能量生成和轉(zhuǎn)化（C），此外，無(wú)機(jī)離子運(yùn)輸代謝（P）、轉(zhuǎn)錄作用（K）和核糖體合成、RNA翻譯（J）等功能基因群所占比例也比較大。

2.2.2 Unigene表達(dá)差異分析 以KPG為對(duì)照，比較了KP2菌株基因表達(dá)情況，數(shù)據(jù)顯示KP2菌株中差異表達(dá)基因總數(shù)為505個(gè)，其中有242基因上調(diào)和263個(gè)基因下調(diào)。對(duì)KP2相對(duì)KPG的差異表達(dá)基因進(jìn)行Pathway分析，結(jié)果表明KP2的505個(gè)差異表達(dá)基因中共有453個(gè)差異基因比對(duì)至113個(gè)代謝途徑中。KP2 Pathway分析所得含差異表達(dá)基因最多的代謝途徑如表3所示。

圖4 COG注釋結(jié)果

表3 KPG vs KP2差異表達(dá)基因Pathway分析

由表3可知，通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化獲得的菌株KP2與出發(fā)菌株KPG相比，在全局代謝途徑（ko01110）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko02020、ko04070）、跨膜運(yùn)輸（ko00540、ko02040、ko02060）、碳水化合物代謝（ko00061、ko00760）、 能 量 代 謝（ko00190）、 輔 因 子 代 謝（ko00130、ko00770）和其它物質(zhì)代謝，如核苷酸代謝（ko00230、ko00240）和氨基酸代謝（ko00300、ko00473）等代謝途徑中差異顯著。

通過(guò)Unigene代謝通路分析，獲得木糖代謝和產(chǎn)物合成直接相關(guān)差異表達(dá)基因如圖5所示，其涉及糖酵解、TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑、氧化磷酸化、能量代謝、跨膜運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)生理生化過(guò)程，對(duì)木糖發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇過(guò)程中木糖分解代謝、2，3-丁二醇和乙偶姻代謝、丙酮酸代謝、琥珀酸代謝、乳酸代謝、乙酸代謝有顯著影響。

從肺炎克雷伯氏菌的木糖代謝途徑可知，木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（xylG編碼）主要負(fù)責(zé)將木糖從胞外運(yùn)輸至胞內(nèi)供微生物分解代謝。與KPG菌株相比，xylG在KP2菌中的表達(dá)量上調(diào)了2.9倍，提高了木糖進(jìn)入胞內(nèi)的效率。

在磷酸戊糖途徑中的幾個(gè)關(guān)鍵基因都有不同程度的上調(diào)，編碼磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶的ybjT表達(dá)量上調(diào)了1.24倍，編碼核酮糖激酶的araB表達(dá)量上調(diào)了2.3倍，編碼轉(zhuǎn)酮醇酶tktA表達(dá)量上調(diào)了1.2倍，這些基因的表達(dá)量上調(diào)提高了木糖向磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化的能力，增強(qiáng)了生物體合成所需的還原力，提高了2，3-丁二醇的生產(chǎn)能力，同時(shí)磷酸戊糖途徑的代謝流最終流向糖酵解途徑，也加快了木糖的消耗，提高了木糖的利用能力。

編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的基因pckA其表達(dá)量上調(diào)了2.7倍，該基因在微生物的代謝途徑中產(chǎn)生較多的ATP，為微生物的生長(zhǎng)提供能量，從而加快了菌體的生長(zhǎng)速度，提高了菌株的生長(zhǎng)性能，為底物的消耗和產(chǎn)物的積累奠定基礎(chǔ)。編碼磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA基因表達(dá)量為親本菌株的0.16倍，說(shuō)明由丙酮酸合成磷酸烯醇式丙酮酸的途徑較親本菌株減弱，使丙酮酸的代謝流向其他通路，包括生成2，3-丁二醇的途徑，使2，3-丁二醇的產(chǎn)量增加。

圖5 肺炎克雷伯氏菌的木糖代謝途徑

在副產(chǎn)物乙醇的代謝途徑中編碼乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶的aldH和adhE基因的表達(dá)量分別下調(diào)了0.53和0.028，乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶是生成副產(chǎn)物乙醇的關(guān)鍵酶，乙醇的生成不但與2，3-丁二醇競(jìng)爭(zhēng)碳源，還競(jìng)爭(zhēng)生成2，3-丁二醇所需的還原力，這兩個(gè)基因的下調(diào)即提高了碳源流向2，3-丁二醇的通量，也為2，3-丁二醇的生成提供更多的還原力。

2.3 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵的影響 初始木糖濃度為120 g/L，pH為5.5，通氣量為0.5 L/min，接種量為7%，溫度為35℃，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了150、300和450 r/min 3個(gè)轉(zhuǎn)速梯度發(fā)酵72 h，結(jié)果如表4所示。

表4 轉(zhuǎn)速對(duì)發(fā)酵影響

由表4可以看出，轉(zhuǎn)速為300 r/min和150 r/min時(shí)，2，3-丁二醇的濃度和木糖的消耗速率差別不大，2，3-丁二醇的最大產(chǎn)量分別為34.56 g/L和33.86 g/L。當(dāng)轉(zhuǎn)速增大到450 r/min時(shí)，2，3-丁二醇的產(chǎn)量反而有所減少，最大2，3-丁二醇的產(chǎn)量?jī)H為22.43 g/L。一般來(lái)說(shuō)，過(guò)高的氧濃度不利于2，3-丁二醇的發(fā)酵，轉(zhuǎn)速增大使得發(fā)酵液中溶解氧增加，過(guò)多的木糖用于菌體自身生長(zhǎng)繁殖和生成副產(chǎn)物乙偶姻，用于生成2，3-丁二醇的量相對(duì)減少。在轉(zhuǎn)速為450 r/min時(shí)，雖然木糖利用率達(dá)99.67%，而2，3-丁二醇的濃度低于轉(zhuǎn)速在150 r/min和300 r/min的發(fā)酵條件下，由于轉(zhuǎn)數(shù)過(guò)高木糖的消耗主要用于菌體生長(zhǎng)，只有很少的部分用于合成目標(biāo)產(chǎn)物。綜合考慮2，3-丁二醇的產(chǎn)量，以及菌體的生物量，選擇300 r/min為最合適轉(zhuǎn)速。

2.3.2 pH對(duì)發(fā)酵的影響 初始木糖濃度為120 g/L，通氣量為0.5 L/min，接種量為7%，溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為300 r/min，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了全程為4、5.5和7三個(gè)pH梯度發(fā)酵72 h，結(jié)果見(jiàn)表5。菌體在較低pH值（pH4）時(shí)，木糖的利用率特別低，說(shuō)明在發(fā)酵培養(yǎng)基中pH4時(shí)，菌株利用木糖被強(qiáng)烈的抑制。菌體細(xì)胞內(nèi)的各種酶的活性除了與溫度有關(guān)外，還與發(fā)酵液的pH值密切相關(guān)。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基pH5.5時(shí)，2，3-丁二醇的濃度、得率以及木糖的消耗量和木糖利用率都高于pH7的條件下，這說(shuō)明pH 7時(shí)不利于菌體利用木糖生成2，3-丁二醇，這與前人報(bào)道的略酸的環(huán)境有利于2，3-丁二醇的生成一致，綜合考慮選擇pH 5.5為最適的pH。

表5 pH值對(duì)發(fā)酵影響

表6 通氣量對(duì)發(fā)酵的影響

2.3.3 通氣量對(duì)發(fā)酵的影響 在初始木糖濃度為120 g/L，溫度為35℃，接種量為7%，pH為5.5，攪拌速率為300 r/min，不同通氣條件下發(fā)酵72 h，結(jié)果見(jiàn)表6。在發(fā)酵周期內(nèi)隨著通氣量的增大，菌體濃度逐漸增大，即通氣量增加有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖；而通氣量由0.2 L/min增加到0.8 L/min時(shí)，2，3-丁二醇的濃度和得率隨之增加，在0.8 L/min時(shí)達(dá)到36.37 g/L，但通氣增加到1.1 L/min時(shí)，2，3-丁二醇的濃度大幅度降低，說(shuō)明過(guò)高的通氣（供氧）不利于2，3-丁二醇的生成。綜上所述，最優(yōu)的通氣量為0.8 L/min。

2.3.4 溫度對(duì)發(fā)酵的影響 在初始木糖濃度為120 g/L，接種量為7%，pH為5.5，攪拌速率為300 r/min，通氣量為0.8 L/min的條件下，對(duì)菌株在不同溫度下發(fā)酵72 h，結(jié)果見(jiàn)表7。隨著溫度的增大，菌體濃度表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)溫度由30℃增加到40℃時(shí)，2，3-丁二醇的濃度和得率也先增大后減小，在35℃時(shí)，2，3-丁二醇的濃度達(dá)到最大為44.20 g/L，表明35℃為生產(chǎn)2，3-丁二醇的最適溫度。

表7 溫度對(duì)利用木糖發(fā)酵的影響

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 根據(jù)前面單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，對(duì)pH、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量4個(gè)因素進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)表1因素的水平編碼，進(jìn)行Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，方案與結(jié)果見(jiàn)表8。

2.4.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗(yàn) 利用Design Exper軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到的回歸方程模型為：2，3-BD=43.54-1.51A-1.32B-1.26C-1.04D+1.13AB+1.4AC-0.69CD-6.07A2-7.23B2-5.86C2-5.86D2。2，3-BD為2，3-丁二醇的濃度?；貧w方程及偏回歸系數(shù)方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，該回歸模型 P＜ 0.0001，失擬項(xiàng) P＞0.05，說(shuō)明該模型回歸方程顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型可用。模型R2= 0.996，R2adj= 0.994，說(shuō)明該模型與實(shí)驗(yàn)擬合程度較好，能較好地反映各因素與響應(yīng)值變化的關(guān)系，可用于2，3-丁二醇產(chǎn)量的理論預(yù)測(cè)?；貧w方程中的 A、B、C、D、AB、AC、CD、A2、B2、C2、D2對(duì)2，3-丁二醇產(chǎn)量影響顯著。通過(guò)響應(yīng)面的數(shù)字最優(yōu)組合分析得到的最佳發(fā)酵條件為：溫度34.75℃，pH 5.9，通氣量 0.65 L/min，轉(zhuǎn)速 227.85 r/min，理論預(yù)測(cè)2，3-丁二醇值為最高值43.84 g/L。2.4.3 響應(yīng)面分析 由圖6-C可知，當(dāng)固定轉(zhuǎn)速時(shí)，隨著pH的升高，2，3-丁二醇的產(chǎn)量先升高后降低，趨勢(shì)明顯；當(dāng)固定pH時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加，2，3-丁二醇產(chǎn)量先升高后降低，趨勢(shì)平緩，升高幅度較小。響應(yīng)面等高線密集，轉(zhuǎn)速和pH的交互作用極顯著。圖6-A、B分別為通氣量和溫度、轉(zhuǎn)速和通氣量之間的交互作用，由圖6-A、B可知，固定通氣和轉(zhuǎn)速、溫度和通氣量任一因素，隨著另一因素的升高，2，3-丁二醇的產(chǎn)量均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。轉(zhuǎn)速與通氣量、通氣量和溫度之間的交互作用極顯著。

表8 Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

2.4.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面優(yōu)化所得最優(yōu)條件：溫度34.75℃，pH 5.9，通氣量 0.65 L/min，轉(zhuǎn)速 227.85 r/min，理論預(yù)測(cè)2，3-丁二醇值為最高值43.84 g/L?？紤]到發(fā)酵罐的控制問(wèn)題，將通氣量修正為0.7 L/min，轉(zhuǎn)速修正為230 r/min，溫度修正為35℃，pH修正為6.0，在此條件下實(shí)測(cè)2，3-丁二醇的含量為43.75 g/L，優(yōu)化前僅為32.96 g/L，2，3-丁二醇的產(chǎn)量提高了32.7%。

表9 回歸方程的方差分析

圖6 溫度和通氣、通氣和轉(zhuǎn)速、pH和轉(zhuǎn)速分別對(duì)2，3-丁二醇產(chǎn)量交互影響的響應(yīng)面

3 討論

微生物在不同環(huán)境脅迫下的耐受性對(duì)于生物燃料和生物化學(xué)品的有效生產(chǎn)有重要意義，因此篩選具有高耐性的菌株成為人們的研究熱點(diǎn)。人們?cè)谖⑸锞N選育上也具有豐富的經(jīng)驗(yàn)。首先是從微生物的自然生存環(huán)境中分離微生物，特別是具有特殊性狀，如高溫、耐溫等微生物，但是從自然界直接分離到的野生型菌株積累產(chǎn)物的能力往往很低，無(wú)法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要；其次經(jīng)過(guò)誘變篩選具有優(yōu)良遺傳性狀的菌株，誘變育種雖然突變率高，但其表型隨機(jī)、遺傳性質(zhì)不穩(wěn)定［24］。本研究通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法在非致命壓力的條件下，篩選出具有高木糖耐性并且其表型和遺傳性質(zhì)穩(wěn)定的突變菌株。

目前，由于高耐受性生產(chǎn)菌株對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義，越來(lái)越多的人致力于耐受性及其分子機(jī)制的研究。Weidmann等［25］通過(guò)在乳酸乳球菌中過(guò)表達(dá)嗜酸酒球菌的sHsp，篩選出了具有耐熱和耐酸的乳酸乳球菌，從而提高了工業(yè)菌株的生產(chǎn)性能。Amira等［26］將LmVHA-E1基因從鹽藻屬植物的葉子中分離出來(lái)，并轉(zhuǎn)移到擬南芥中，以提高其對(duì)高鹽度和干旱脅迫的耐受性。其研究結(jié)果表明，高鹽度和耐干旱耐受性的提高是由于與應(yīng)激相關(guān)基因（如AtNHX1 AtP5CS，AtCAT，AtSOD，AtPOD和AtLEA）表達(dá)水平的提高導(dǎo)致鈉離子進(jìn)入到液泡的能力，滲透調(diào)節(jié)的能力和轉(zhuǎn)基因植物的活性氧清除能力提高。Gao等［27］通過(guò)隨機(jī)插入缺失鏈交換誘變方法設(shè)計(jì)全局調(diào)控因子rpoD基因，篩選出了具有耐酸性的大腸桿菌突變體，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和表型分析結(jié)果表明，除耐酸性外，大腸桿菌發(fā)生差異的基因中95個(gè)有代表性的基因表達(dá)上調(diào)，178個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)，這些基因在代謝中涉及海藻糖的生物合成，核苷酸的生物合成，碳代謝，氨基酸的利用。一些主要調(diào)控因子（ArcA，EvgA，H-NS，RpoS）和基因 /操縱子特異性轉(zhuǎn)錄因子（GadX，GadW，AppY，YdeO，KdgR）也受到調(diào)控。這些結(jié)果表明，RpoD作為大腸桿菌生長(zhǎng)期的全局調(diào)節(jié)因子，從而提高了其耐酸性。雖然近年來(lái)越來(lái)越多的人們致力于耐受性菌株的研究，但對(duì)高糖耐性的研究較少。本研究通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化的方法篩選到了一株高木糖耐性并且高產(chǎn)2，3-丁二醇的肺炎克雷伯氏菌株KP2，與親本菌株相比其木糖轉(zhuǎn)化率提高了174.5%，2，3丁二醇的總體產(chǎn)量提高了227%。為了解釋產(chǎn)生這種變化的原因，對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果表明與親本菌株相比KP2菌株差異表達(dá)基因總數(shù)為505個(gè)，其中有242基因上調(diào)和263個(gè)基因下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因的Pathway分析結(jié)果表明KP2的505個(gè)差異表達(dá)基因中共有453個(gè)差異基因比對(duì)至113個(gè)代謝途徑中，其中與木糖代謝和產(chǎn)物合成直接相關(guān)差異表達(dá)基因涉及糖酵解、TCA循環(huán)、磷酸戊糖途徑、氧化磷酸化、能量代謝、跨膜運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)生理生化過(guò)程。對(duì)木糖發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇過(guò)程中木糖分解代謝、2，3-丁二醇和乙偶姻代謝、丙酮酸代謝、琥珀酸代謝、乳酸代謝、乙酸代謝有顯著影響。這些結(jié)果說(shuō)明了在適應(yīng)性進(jìn)化的條件下，微生物通過(guò)改變各個(gè)代謝途徑來(lái)適應(yīng)新環(huán)境，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析解釋了高木糖耐性菌株產(chǎn)生這種變化的機(jī)理，為以后的分子生物學(xué)改造提供參考。由此可見(jiàn)，適應(yīng)性進(jìn)化方法作為高耐性菌株的選育途徑在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的前景，轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析方法可以為微生物菌株的工業(yè)生產(chǎn)提供借鑒。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化篩選出一株高木糖耐性并高產(chǎn)2，3-丁二醇的突變菌株KP2，并對(duì)原始菌株KPG和突變菌株KP2進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果顯示：KP2菌株差異表達(dá)基因總數(shù)為505，其中有242個(gè)基因上調(diào)和263個(gè)基因下調(diào)。差異表達(dá)基因Pathway分析表明，轉(zhuǎn)錄水平的變化主要表現(xiàn)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜運(yùn)輸、碳水化合物代謝、能量代謝和其它物質(zhì)代謝。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法探究了pH、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量對(duì)2，3-丁二醇產(chǎn)量的影響，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為：pH 5.9、溫度35℃、轉(zhuǎn)速230 r/min、通氣量0.7 L/min，最優(yōu)條件下2，3-丁二醇產(chǎn)量高達(dá)43.75 g/L，相比優(yōu)化前提高32.7%。

本研究獲得了高效利用木糖生產(chǎn)2，3-丁二醇的菌株，對(duì)表型變化產(chǎn)生的機(jī)理在分子水平上進(jìn)行闡述，并得到了最優(yōu)的發(fā)酵條件，結(jié)果可以為2，3-丁二醇的生物轉(zhuǎn)化提供參考，對(duì)2，3-丁二醇的生物法生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。