張雪嬌，王立志，王之盛，薛 白，彭全輝

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，成都 611130）

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)生活著大量的細(xì)菌、原蟲、真菌和古菌等厭氧微生物[1-3]，這些微生物與它們的宿主之間是一種互利互惠的共生關(guān)系[4-5]。宿主攝入的飼料是這些微生物生長(zhǎng)繁殖唯一的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，而微生物將飼料在瘤胃中進(jìn)行發(fā)酵又促進(jìn)了宿主對(duì)日糧中營(yíng)養(yǎng)素的利用。在反芻動(dòng)物消化利用飼糧纖維的過(guò)程中，瘤胃微生物的作用尤其重要[6]。飼料中的纖維類物質(zhì)在反芻動(dòng)物日糧中的比例一般在30%以上，動(dòng)物自身沒有分泌纖維降解酶的能力，它們對(duì)日糧纖維的利用完全依賴于瘤胃微生物[7]。

已有的研究表明，瘤胃微生物的結(jié)構(gòu)與組成直接影響宿主利用纖維的能力[8]。就細(xì)菌而言,瘤胃中降解纖維的微生物主要有白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸擬桿菌等[9]，提高它們?cè)诹鑫钢械南鄬?duì)豐度能顯著提高飼料纖維的消化率[10]。疣微菌科的細(xì)菌與纖維代謝的關(guān)系也非常密切，這類菌瘤胃數(shù)量的減少會(huì)導(dǎo)致日糧纖維消化率的顯著降低[11]。棲瘤胃普雷沃氏菌雖不能直接降解纖維素，但是它能夠通過(guò)與黃色瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌這類纖維分解菌共生，從而提高日糧中纖維素的降解[12]。但反之，目前人們對(duì)于日糧纖維水平對(duì)瘤胃微生物，尤其是對(duì)山羊瘤胃古菌結(jié)構(gòu)與組成的影響了解還很少。這方面知識(shí)的缺乏，限制了人們對(duì)宿主與瘤胃微生物互作關(guān)系的理解。針對(duì)這一問(wèn)題，本試驗(yàn)以山羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物，采用高通量測(cè)序技術(shù)主要研究了飼糧NDF水平對(duì)山羊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率及瘤胃古菌的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用3×3拉丁方設(shè)計(jì)，按照日糧NDF濃度設(shè)3個(gè)處理組，將山羊生產(chǎn)中常用日糧的NDF濃度設(shè)為中濃度組（MN組∶NDF值=40.10%），在此基礎(chǔ)上將日糧NDF水平增加或減少5%，即高濃度NDF水平組（HN組∶NDF=45.16%）和低濃度組（LN組∶NDF值=35.01%）。試驗(yàn)動(dòng)物為6只8月齡健康雄性山羊，平均體重為（28.33±3.77）kg。日糧配方參照中國(guó)肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（2004）以每天每頭羊增重0.1 kg進(jìn)行配制（表1）。將6只山羊按照兩兩一組分成3組，分3期進(jìn)行代謝試驗(yàn)。每期試驗(yàn)為期20 d，其中前14 d為預(yù)試期，后6 d為正試期。每期試驗(yàn)均有2頭羊飼喂3個(gè)處理組中的一組日糧。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊在全期單籠飼養(yǎng)，自由飲水。根據(jù)預(yù)試期動(dòng)物的采食量，正試期每天每只羊飼喂由粗料和精料組成的全混合日糧1.2 kg，分別于每日09:00及17:00分兩次進(jìn)行等量飼喂。記錄每天每頭羊的飼料供給量和余料量。

1.3 樣品采集

在正試期收集每只羊每天排泄的全部糞便和尿液，加10%的鹽酸固氮，-20℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。每組羊在每期代謝試驗(yàn)結(jié)束后的次日晨飼后兩小時(shí)抽取50 mL瘤胃內(nèi)容物，具體步驟參照王立志等[13]描述的方法進(jìn)行。將得到的瘤胃內(nèi)容物裝入充滿氮?dú)獾募瘹獯?，置于冰上，反?fù)拍打以確保和固相結(jié)合的微生物能充分進(jìn)入瘤胃液中，然后再用4層紗布過(guò)濾得到瘤胃液，-80℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)瘤胃液微生物DNA的提取。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table1 Composition and nutrient levels of experimental diets(basis on DM)

1.4 飼料、糞尿指標(biāo)檢測(cè)

飼料中的干物質(zhì)（DM）、有機(jī)物（OM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、粗灰分（Ash）、NDF及糞氮和尿氮等常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分均參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》中方法進(jìn)行測(cè)定[14]。飼料、糞尿中能量采用氧彈測(cè)熱儀（Parr 1281，America）測(cè)定。

1.5 微生物總DNA的提取和高通量測(cè)序

瘤胃液微生物總DNA的提取：用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的糞便基因組DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書介紹的步驟提取。以提取的瘤胃微生物總DNA為模板，采用古菌的特異性引物對(duì)（Arch519F和Arch915R），針對(duì)古菌16S rRNA的V4+V5區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。具體擴(kuò)增步驟參照文獻(xiàn)[15-16]描述的方法進(jìn)行。檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾禾致源生物科技有限公司用IlluminaHiSeq 250 PE平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.6 生物信息學(xué)分析

將測(cè)序所得reads使用FLASH軟件進(jìn)行雙端merge后，用QIIME軟件按照barcode序列進(jìn)行不同樣品的區(qū)分，去除低質(zhì)量序列得到有效序列。去低質(zhì)量序列標(biāo)準(zhǔn)如下：去除所有含有N的reads；去除含有連續(xù)3個(gè)小于Q20堿基的reads；去除與barcode序列不一致的reads；去除連續(xù)Q20堿基長(zhǎng)度小于序列總長(zhǎng)75%的reads。使用UCLUST[17]軟件對(duì)有效序列進(jìn)行聚類，根據(jù)相似性≥97%將序列聚類成為OTUs（operational taxonomic units），并挑選豐度最高的序列作為OUT的代表性序列；使用QIIME軟件將OTU代表序列與古菌的SILVALVA（http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)[18]進(jìn)行比對(duì)，然后用Mothur方法對(duì)古菌的代表序列進(jìn)行物種注釋分析（閾值設(shè)定在0.8～1之間），統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在各分類水平上（門，綱，目，科，屬）的構(gòu)成；采用QIIME軟件（Version 1.7.0）計(jì)算各個(gè)樣品Alpha多樣性指數(shù)（Shannon 指數(shù)、ChaoI指數(shù)、The_observed_species指數(shù)）并做rarefaction分析，利用R語(yǔ)言工具[19]繪制稀釋曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果用一般線性模型Yij（k）=μ+αi+βj+γ（k）+εij（k）（i=j=k=1，2，3）表示，其中Y為某指標(biāo)的觀測(cè)值，μ為試驗(yàn)全部觀測(cè)值總體平均數(shù)；α，β，γ分別為本研究中試驗(yàn)期、羊組別和日糧NDF水平，ε為隨機(jī)誤差。用SPSS 21.0軟件中的ANOVA模塊用以NDF水平為主要影響因素，且與其他兩種影響因素?zé)o互作效應(yīng)的方法對(duì)處理組間觀測(cè)值平均數(shù)（μ）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，并用鄧肯法進(jìn)行多重比較；同時(shí)，用日糧NDF水平對(duì)瘤胃古菌屬的相對(duì)豐度進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P＜0.05表示顯著，P＜0.01為極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧NDF水平對(duì)山羊生長(zhǎng)性能的影響

從表2可看出，處理間山羊的IBM、FBW均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。LN組的 ADG顯著（P＜0.05）高于HN組，但LN組與MN組的差異不顯著（P＞0.05）。DMI有隨日糧NDF水平的升高而降低的趨勢(shì)，但3組間差異不顯著（P＞0.05）。LN組和MN組的料重比顯著低于HN組（P＜0.05），但LN組和MN組的差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 飼糧NDF水平對(duì)山羊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

從表3可以看出，處理組間山羊日糧DM、OM、CP表觀消化率差異均不顯著（P＞0.05）；LN組EE的表觀消化率顯著高于MN組和HN組（P＜0.05）；HN組NDF的表觀消化率顯著高于LN組和MN組（P＜0.05）。

2.3 飼糧NDF水平對(duì)山羊瘤胃古菌結(jié)構(gòu)與組成的影響

2.3.1 各樣品測(cè)序深度和OTU數(shù)量分析

本次測(cè)序總共得到1 002 079條有效序列（Clean Data），每個(gè)樣品的平均序列數(shù)為334 026±15 321，按照相似性≥97%的標(biāo)準(zhǔn)把得到的有效序列進(jìn)行聚類，共得到6 997個(gè)OTUs，每個(gè)樣品的平均OTUs數(shù)為2 332.3±453.5，3個(gè)處理組間共享OTUs數(shù)為441個(gè)，LN組與MN組間共享OTUs數(shù)為554個(gè)，LN組與HN組間共享OTUs數(shù)為523個(gè)，MN組與HN組間共享OTUs數(shù)為453個(gè)（圖1）。

2.3.2 OTU稀釋曲線

各樣品的OTU稀釋曲線見圖2。由圖2可看出，在本次研究的測(cè)序深度下（reads：47 650）各樣品的稀疏曲線最終都趨于平緩。說(shuō)明本次研究采用的測(cè)序技術(shù)基本可以覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物。

2.3.3 Alpha多樣性指數(shù)

本試驗(yàn)利用QIIMEPipeline在取樣深度為47 650時(shí)對(duì)3個(gè)處理組瘤胃液樣的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行了比較分析（表4）。從表4可看出，LN組Chao l指數(shù)、Shannon指數(shù)和Observed species指數(shù)值顯著（P＜0.05）高于MN組和HN組，MN組和HN組間的差異不顯著，說(shuō)明LN組山羊瘤胃內(nèi)微生物菌群的豐富度和均勻度均最高。

表2 飼糧NDF水平對(duì)山羊生長(zhǎng)性能的影響Table2 Effects of dietary NDF levels on growth performance of goats

表3 飼糧NDF水平對(duì)山羊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響Table3 Effects of dietary NDF levels on apparent digestibility of dietary nutrients in goats %

圖1 OTU維恩圖Figure1 OTU Venn diagram

圖2 OTU稀釋曲線Figure2 The OTU rarefaction curves across all samples

經(jīng)過(guò)物種注釋和統(tǒng)計(jì)，本次測(cè)序的古菌共可分為3個(gè)門，5個(gè)綱，5個(gè)目，5個(gè)科，7個(gè)屬。在門水平上，所有物種的相對(duì)豐度在3個(gè)處理組間差異均不顯著（P＜0.05）。廣古菌門（Euryarchaeota）在3個(gè)處理組中均為優(yōu)勢(shì)古菌門，平均相對(duì)豐度達(dá)（99.99±0.01）%。

各樣品在屬水平上的物種組成見圖3。3個(gè)處理組的前3個(gè)優(yōu)勢(shì)古菌屬均依次分別為Methanobrevibacter、Candidatus_Methanomethylophilus和Candidatus_Methanoplasma。其他各屬的相對(duì)豐度都在1%以下。Methanobrevibacter的相對(duì)豐度呈現(xiàn)隨日糧NDF水平的升高而增加的變化規(guī)律，且LN組與其他兩組的差異達(dá)到了極顯著的水平（P＜0.01），其他兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；Candidatus_Methanomethy-lophilus和Candidatus_Methanoplasma的相對(duì)豐度隨NDF水平的升高呈降低的變化規(guī)律，且LN組顯著高于其他兩組（P＜0.05）（表 5），其他古菌屬兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）；其余各菌屬的相對(duì)豐度在3個(gè)處理組間差異均不顯著（P＞0.05）。用組間具有顯著差異古菌屬的相對(duì)豐度與日糧NDF濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，日糧NDF濃度與Candidatus_Methanomethylophilus和Candidatus_Methanoplasma之間沒有顯著相關(guān)性，只與Methanobrevibacter呈極顯著正相關(guān)（表5）。

表4 在取樣深度為47 650時(shí)各組α多樣性指數(shù)的對(duì)比Table4 Comparison of alpha diversity of each group calculated at a depth of 47 650 sequences

圖3 各個(gè)樣品瘤胃古菌在屬水平上的物種組成Figure3 The composition of rumen archaeal at the genus level across all samples

2.3.4 共享屬分析

3個(gè)處理組共享的古菌屬只有4個(gè)，按照菌群相對(duì)豐度的高低依次是產(chǎn)甲Methanobrevibacter（74.86±19.86）%，Candidatus_Methanomethylophilus（17.20±9.27）%、Candidatus_Methanoplasma（6.74±10.38）%和 Methanosphaera（0.22±0.07）%。其中，Methanobrevibacter和Candidatus_Methanomethylophilus均為3個(gè)處理組的優(yōu)勢(shì)核心菌群且都屬于廣古菌門（Euryarchaeota）。

3 討論

3.1 飼糧NDF水平對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

許多研究都已報(bào)道并證明了日糧NDF水平會(huì)影響動(dòng)物日糧的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率。張立濤等[20]研究表明，隨著日糧NDF水平的升高，DM、OM、EE的表觀消化率會(huì)逐漸降低，并呈現(xiàn)顯著性差異。本試驗(yàn)研究表明，LN組的EE表觀消化率顯著高于MN和HN組，與上述研究結(jié)果一致。但本試驗(yàn)中DM和OM表觀消化率并未隨日糧NDF水平的升高而顯著降低，這可能與羊的品種以及飼糧的組成成分的差異有關(guān)。周漢林等[21]研究公牛日糧NDF水平在30%～42%之間變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，NDF的表觀消化率隨NDF水平的升高而升高。K.E.Tjardes等[22]研究表明，與低纖維組相比，高纖維濃度組的奶牛日糧NDF消化率增加了9.4%?？紫楹频萚23]的研究也發(fā)現(xiàn)了這種變化規(guī)律，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。這些試驗(yàn)說(shuō)明，在一定范圍內(nèi)提高日糧NDF水平，可以提高動(dòng)物對(duì)NDF消化率。理論上分析，隨著日糧某種營(yíng)養(yǎng)素含量的增加，其消化率會(huì)隨之降低。本試驗(yàn)中CF和NDF的消化率之所以會(huì)隨其日糧濃度的增加而增加，一方面可能是HN組山羊在采食高NDF水平日糧后，瘤胃排空速度減慢致使食糜在瘤胃內(nèi)的停留時(shí)間延長(zhǎng)，這樣就使得瘤胃有充分的時(shí)間對(duì)日糧中CF和NDF進(jìn)行消化，導(dǎo)致CF和NDF的消化率提高；另一方面從微生物角度來(lái)講，可能是HN組山羊采食高NDF水平日糧，由于底物濃度的增加，在底物誘導(dǎo)效應(yīng)的作用下，瘤胃內(nèi)一些能夠降解纖維的菌群如瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌的相對(duì)豐度增加（本課題組待發(fā)表數(shù)據(jù)），促進(jìn)了纖維在瘤胃內(nèi)的消化，從而使HN組山羊的CF和NDF表觀消化率顯著高于其他兩組。

表5 處理組間存在顯著差異的古菌屬及其與NDF消化率的相關(guān)性Table5 The archaeal genera which were significantly different between groups and their correlation with NDF digestibility

3.2 飼糧NDF水平對(duì)山羊瘤胃古菌結(jié)構(gòu)與組成的影響

飼糧NDF水平不僅顯著影響山羊瘤胃細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)與組成，本試驗(yàn)表明其對(duì)山羊瘤胃古菌菌群也會(huì)產(chǎn)生顯著影響。截至目前，有關(guān)NDF水平對(duì)瘤胃古菌的影響還未見他人的研究報(bào)道，相近的研究主要集中在日糧類型對(duì)產(chǎn)甲烷古菌的影響上。Lin C.等[24]證實(shí)日糧類型對(duì)山羊和牛等瘤胃產(chǎn)甲烷菌群有很大影響，日糧由低精料轉(zhuǎn)變?yōu)楦呔蠒r(shí)，瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌由產(chǎn)甲烷桿菌目轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)甲烷微菌目。A.D.Wright等[25]先后分別研究了飼喂不同粗飼料來(lái)源的日糧時(shí)綿羊和牛瘤胃內(nèi)古菌的多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象時(shí)，不論是在以完全放牧為日糧還是以燕麥-干草和蓋氏虎尾干草為基礎(chǔ)日糧時(shí)，綿羊瘤胃中的優(yōu)勢(shì)古菌均是甲烷短桿菌；但以牛為研究對(duì)象時(shí)，給動(dòng)物飼喂紫花苜蓿干草為主的日糧，牛瘤胃中的優(yōu)勢(shì)古菌主要是可活動(dòng)的甲烷微菌，其次是甲烷短桿菌。

目前有許多研究學(xué)者通過(guò)對(duì)瘤胃內(nèi)微生物16S rRNA基因序列的研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃內(nèi)古菌占到了瘤胃微生物的0.3%～3.3%[26]，主要以產(chǎn)甲烷菌為主，均屬于廣古菌門[27]。本次研究也發(fā)現(xiàn)山羊瘤胃中廣古菌門是優(yōu)勢(shì)古菌門。但本研究中，3個(gè)處理組廣古菌門的豐度分別都達(dá)到了99%，如此高的相對(duì)豐度在以往的研究中還未曾報(bào)道過(guò)。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是本次研究所用的引物（瘤胃古菌的特異性引物，Arch519F和Arch915R）和古菌序列比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)（瘤胃古菌專用比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)）與以往研究不同所造成的。本次研究還發(fā)現(xiàn)，甲烷短桿菌（Methanobrevibacter）是3個(gè)處理組的優(yōu)勢(shì)菌屬，且LN組該菌的豐度極顯著低于其他兩組（P＜0.01），該菌的豐度隨NDF水平的升高呈增加的變化規(guī)律。出現(xiàn)以上結(jié)果的原因可能與甲烷短桿菌的特性密切相關(guān)，該菌是一類典型的氫利用菌。黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌等在分解纖維的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量氫離子，氫對(duì)于絕大多數(shù)瘤胃微生物都有生物毒性，高氫分壓不利于維持正常的瘤胃微生物生長(zhǎng)繁殖。關(guān)于甲烷短桿菌的許多研究都表明，其產(chǎn)甲烷的主要發(fā)酵底物是H2和CO2，它能將纖維發(fā)酵產(chǎn)生的氫合成甲烷后通過(guò)噯氣排出瘤胃[28]，雖然不利于環(huán)保，但對(duì)于維持瘤胃中的正常H2分壓有著重要的意義[29]。在本試驗(yàn)中，HN組和MN組動(dòng)物瘤胃內(nèi)的高纖維含量可能需要更多的甲烷短桿菌來(lái)執(zhí)行對(duì)H2的清除作用，因此該菌在LN組極顯著低于其他兩組。

4 結(jié)論

廣古菌門是山羊瘤胃優(yōu)勢(shì)的古菌。飼糧NDF水平在35%～45%之間變化時(shí)，隨NDF濃度增加，日糧NDF的表觀消化率顯著升高，山羊瘤胃古菌在門水平上的結(jié)構(gòu)與組成不會(huì)受到顯著影響，但屬水平上Methanobrevibacter、Candidatus_Methanomethylophilus等古菌的相對(duì)豐度會(huì)受到顯著影響。