陳銀竹， 丁 偉， 劉勝男， Muhammad Shahid khan，2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000； 2.白沙瓦農(nóng)業(yè)大學(xué)，巴基斯坦白沙瓦 1599107)

近年來，基因工程技術(shù)發(fā)展勢頭迅猛，種植業(yè)中以轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的發(fā)展最為迅速。而大豆為我國重要的糧食作物，雜草防除一直是大豆種植過程中的重點問題?；瘜W(xué)除草是大豆田防除雜草的重要手段，近幾年大豆田化學(xué)除草面積已達(dá)其播種面積的90%以上[1]。轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的出現(xiàn)便為人們提供了一種能有效控制雜草的新途徑，不僅大大降低了除草成本和勞動強(qiáng)度，并且有效延緩了大豆田抗性雜草的出現(xiàn)，除草劑藥害的發(fā)生也明顯降低，已成為美洲地區(qū)大豆田雜草防除的重要方法之一。草甘膦由美國孟山都公司研制開發(fā)，目前是世界上除草劑使用量最大的品種之一[2]。草甘膦通過抑制莽草酸途徑中的5-烯醇式丙酮莽草酸-3- 磷酸合成酶(EPSPS)，使微生物和植物不能合成生存必需的芳香族氨基酸而導(dǎo)致死亡[3-4]。其特點是殺草譜廣、傳導(dǎo)性好、殘效低，在轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆整個生育期都可以使用。國內(nèi)外普遍將草甘膦應(yīng)用于莖葉處理，而對應(yīng)用草甘膦進(jìn)行種子處理的安全性和雜草防除效果鮮有研究。本試驗通過草甘膦種子處理和莖葉處理研究草甘膦的安全性，為減少草甘膦的用量和我國當(dāng)前自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的安全應(yīng)用提供理論依據(jù)。

已有的研究表明，一定濃度的草甘膦會造成轉(zhuǎn)基因大豆葉片的葉綠素含量降低、葉綠體結(jié)構(gòu)變化和光合速率下降，葉綠素恢復(fù)過程需要2周左右，莽草酸含量幾乎沒有變化[5-11]。Bellaoui等研究表明，草甘膦會影響轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的碳代謝和氮代謝[12]。種子用草甘膦溶液浸泡后播于土壤中，敏感的大豆種子浸泡4 h后不能發(fā)芽，而轉(zhuǎn)基因種子均能順利發(fā)芽生長[13-14]。草甘膦莖葉處理能有效控制雜草，但噴施超過推薦劑量1.23～2.46 kg a.i./hm2會降低成熟期的單株粒數(shù)和單株產(chǎn)量[15]。美國研究證明，在田間無草的條件下，抗草甘膦大豆平均減產(chǎn)5%～10%，但由于雜草防效提高，最終抗草甘膦大豆產(chǎn)量增加[16]。本研究通過對草甘膦種子處理和莖葉處理來研究轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的安全性，期望降低草甘膦用量的同時獲得理想的田間雜草防除效果，從而為草甘膦的合理應(yīng)用及我國自主研發(fā)轉(zhuǎn)基因大豆在生產(chǎn)中的安全應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

供試大豆為轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆呼交06-698，供試除草劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑(美國孟山都公司)。

試驗于2015年于5—10月在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗地進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，41%草甘膦異丙胺鹽水劑設(shè)4個處理水平，每個處理4次重復(fù)(表1)。莖葉處理在大豆第1張復(fù)葉完全展開后施藥(此時為種子處理后33 d)，出苗后按照常規(guī)方式進(jìn)行田間管理，在莖葉處理后7、14、21、28 d(DAT)記錄各處理內(nèi)雜草數(shù)，同時取樣測定大豆生理指標(biāo)，連續(xù)4次取樣完畢后對各處理內(nèi)雜草進(jìn)行稱質(zhì)量。

表1 草甘膦用量

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 除草效果的計算 草甘膦莖葉處理后7 d和草甘膦種子處理播種后40 d，每隔7 d監(jiān)測各處理雜草數(shù)量，計算雜草株防效及鮮質(zhì)量防效。計算公式如下：

1.2.2 生理指標(biāo)的測定 草甘膦莖葉處理后7 d和種子處理播種后40 d，取樣測定各處理單株大豆株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量、光合速率和莽草酸含量。

參照丁偉等提出的分光光度比色法測定大豆葉綠素含量[17]。量取5 mL二甲基亞砜(DMSO)加入到干凈的血清瓶中，稱質(zhì)量，將大豆葉片新鮮組織加入血清瓶中，再稱質(zhì)量，放入暗室浸提。浸提24 h后，移取1 mL浸提液加入到5 mL的DMSO中混勻。在波長645、663 nm下用空白做對照測定吸光度，計算葉綠素含量：

式中：D1為645 nm處吸光度；D2為663 nm處吸光度；V1為樣品提取液總體積(mL)；K為樣品顯色稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量(g)。

光合速率采用美國LI-6400XT便攜式光合速率測定儀測定。Li-6400XT葉室CO2濃度設(shè)定為 400 μmol/mol，溫度為22.5 ℃，空氣相對濕度為40%～50%。選擇晴天09：00—11：00，測定各處理大豆的光合速率。

莽草酸含量的測定參照Cromartie等的方法[18]，通過分光光度計進(jìn)行測定。取樣放于冰盒中帶回進(jìn)行測定。測定時，取0.1 g樣品剪成碎片放入小瓶中，然后加 0.25 mol/L HCl溶液到2 mL，浸泡90 min，期間每隔30 min晃動1次。向試管中加2 mL氧化劑溶液(0.25%高碘酸溶液與0.25%偏高碘酸鉀溶液配制而成)，然后加入0.5 mL培養(yǎng)后的待測液，室溫下反應(yīng)60 min，再加入2 mL的顯色溶液(0.6 mol/L NaOH和0.22 mol/L Na2SO3溶液配制而成)，在380 nm下測定吸光度，每個樣品重復(fù)3次。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：加已知量的莽草酸到未噴藥前的提取液中，以每25 μL提取液中所含的莽草酸量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：C為提取液莽草酸含量(μg/mL)；V為提取液的總體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將試驗所得的數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行整理，并采用 DPS 7.05 數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行5%差異顯著水平檢測分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對轉(zhuǎn)基因大豆的雜草防除效果

應(yīng)用草甘膦處理過的轉(zhuǎn)基因大豆雜草防除效果明顯，并且不同劑量處理間差異顯著。根據(jù)施藥組與未施藥組的雜草數(shù)，可以計算出3組草甘膦處理的株防效與鮮質(zhì)量防效，由于莖葉處理為大豆三葉期施藥，藥后7 d開始調(diào)查，因此莖葉處理的防除效果最為明顯。在2組種子處理中，草甘膦劑量為562.5 g a.i./hm2的處理組防除效果較好，從種子處理后 40 d 開始的株防效為73.25%，直至三葉期后28 d，其株防效仍在50%以上，并且整個測定周期與112.5 g a.i./hm2的低劑量種子處理相比均存在顯著差異(表2)。

表2 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的株防效和鮮質(zhì)量防效

注：不同小寫字母表示不同處理相同處理時間在0.05水平上差異顯著。下表同。

2.2 草甘膦對轉(zhuǎn)基因大豆株高及鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的影響

在莖葉處理21 d后、種子處理54 d后，草甘膦處理組與對照組的大豆鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及株高均無顯著差異(表3)。

2.3 草甘膦對轉(zhuǎn)基因大豆葉綠素含量及光合速率的影響

由表4可知，應(yīng)用草甘膦的處理組轉(zhuǎn)基因大豆葉綠素含量均低于未使用草甘膦的對照組，說明草甘膦的應(yīng)用對大豆葉綠素含量起到了抑制作用。其中，562.5 g a.i./hm2種子處理組的葉綠素含量在種子處理后40 d時與未施藥組相比顯著降低，在47 d時種子處理組葉綠素含量恢復(fù)正常。而莖葉處理方面，葉綠素抑制率在施用后14 d達(dá)到最大，隨后草甘膦對葉綠素的抑制作用減弱，從莖葉處理后21 d開始，葉綠素含量恢復(fù)正常。

光合速率方面，草甘膦各個處理組的轉(zhuǎn)基因大豆光合速率均低于未使用草甘膦的對照組，說明草甘膦的應(yīng)用抑制了大豆光合速率。其中，562.5 g a.i./hm2種子處理組的光合速率在種子處理后40 d時與未施藥組和112.5 g a.i./hm2的低劑量種子處理組相比顯著降低，在47 d時種子處理組光合速率恢復(fù)正常。而施用1 125 g a.i./hm2草甘膦的莖葉處理組光合速率抑制率在施用后14 d達(dá)到最大，隨后草甘膦對光合速率的抑制作用降低，從莖葉處理后21 d開始光合速率恢復(fù)正常。

表3 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的株高和鮮質(zhì)量、干質(zhì)量

表4 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的葉綠素含量及光合速率

2.4 草甘膦對轉(zhuǎn)基因大豆莽草酸含量的影響

從表5中可以看出各處理間莽草酸含量差異不顯著，可見應(yīng)用草甘膦處理的轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆莽草酸含量受草甘膦影響不明顯。

3 討論與結(jié)論

大豆是我國重要的糧食作物。除草劑的大量使用導(dǎo)致抗藥性雜草出現(xiàn)。長殘留除草劑的使用及除草劑施用前后環(huán)境條件的影響也使作物藥害頻發(fā)，如在東北地區(qū)大豆田，咪唑乙煙酸、氯嘧磺隆等除草劑施用后長期殘留在土壤中，對后茬敏感作物造成嚴(yán)重藥害，損失巨大[19]。近年來，轉(zhuǎn)基因抗除草劑大豆已成為北美和南美洲地區(qū)大豆田雜草防除的重要而有效的途徑。已有研究表明，草甘膦在922.5～2 460.0 g a.i./hm2劑量范圍內(nèi)，對轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的安全性較好[20]。本試驗采用草甘膦種子和莖葉處理對我國目前研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆呼交06-698的安全性進(jìn)行了研究，表明草甘膦對該大豆品種安全。

應(yīng)用草甘膦處理的轉(zhuǎn)基因大豆田間雜草防除效果顯著，草甘膦種子處理對雜草也有較明顯的防除效果，相對于莖葉處理的優(yōu)勢在于可在一定時期內(nèi)明顯控制大豆植株周圍雜草發(fā)生，有效降低草甘膦的用量，減少除草劑對農(nóng)田環(huán)境污染，此外采用草甘膦種子處理可以在室內(nèi)快速測定草甘膦對轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的安全性。

施用草甘膦后，轉(zhuǎn)基因大豆葉綠素含量、植株生長量、根瘤生物量和根瘤固氮作用均降低[21-23]。草甘膦可抑制葉綠體RNA、 葉綠體核糖體以及色素的形成。葉綠素含量作為植物生理性狀的一個重要指標(biāo)，反映了光合能力的大小，通過噴施草甘膦后葉綠素變化，可了解草甘膦對光合作用的影響。從試驗結(jié)果可以看出，葉綠素含量和光合速率變化趨勢大致相同，表明草甘膦施用后對這2項指標(biāo)的抑制作用明顯，但隨著時間的延長抑制作用開始降低，草甘膦莖葉處理后28 d、種子處理后61 d葉綠素含量和光合速率恢復(fù)到正常水平。植株生長方面，在莖葉處理后21 d、種子處理后54 d，草甘膦處理與對照大豆鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及株高均恢復(fù)正常水平。

表5 轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆的莽草酸含量

草甘膦對植物體內(nèi)EPSPS有專一抑制作用[24]。通常處理后1 d，莽草酸便開始積累，4～7 d達(dá)高峰，測定葉片內(nèi)莽草酸含量可反映草甘膦所造成的藥害的程度[25]。本研究結(jié)果表明草甘膦對中國目前研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆呼交06-698安全，可用于轉(zhuǎn)基因抗草甘膦大豆田雜草防除，可通過草甘膦種子處理快速檢測草甘膦對轉(zhuǎn)基因大豆的安全性。