邵亦心 王朵勤 沈燕蕓 朱奕锜 徐金華 唐慧

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

肥大細(xì)胞作為固有免疫細(xì)胞之一，廣泛分布于皮膚、呼吸道、消化道黏膜等外界屏障組織，通過IgE依賴及非IgE依賴性途徑釋放各種致敏介質(zhì)、細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，在過敏性、感染性、炎癥性及免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［1］。目前常用的肥大細(xì)胞株，包括人肥大細(xì)胞系HMC?1、LAD2，大鼠嗜堿性粒細(xì)胞來源的RBL2H3，小鼠肥大細(xì)胞系P815等，都不同程度地缺乏成熟肥大細(xì)胞的功能與特性，如HMC?1細(xì)胞IgE高親和力受體（FcεRⅠ）表達水平低，LAD2細(xì)胞培養(yǎng)成本高、周期長，一些細(xì)胞因子表達水平較低等［2］。因此原代培養(yǎng)高純度的哺乳動物肥大細(xì)胞將成為研究肥大細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的有效手段。本研究旨在通過簡單方法分別對小鼠腹腔及骨髓細(xì)胞進行白細(xì)胞介素3（IL?3）和干細(xì)胞因子（SCF）聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)，以獲得大量高純度肥大細(xì)胞，并鑒定其脫顆粒功能，為相關(guān)疾病免疫機制及治療后續(xù)研究奠定細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.實驗動物：雌性C57BL/6小鼠12只，6～8周齡，SPF級，體重18～22 g，健康狀態(tài)良好，來自上海靈暢生物科技有限公司，許可證號SCXK（滬）2013?0018，合格證號2013001816972。

2.主要試劑：小鼠重組IL?3和SCF來自美國Peprotech公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清來自美國Gibco公司，藻紅蛋白（PE）?CD117、異硫氰酸熒光素（FITC）-FcεRⅠα來自美國eBioscience公司，4-硝基苯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷來自美國Sigma公司。

二、方法

1.小鼠腹腔源性肥大細(xì)胞（peritoneal?derived mastcells，PMC）分離培養(yǎng)：脫頸椎處死小鼠后，無菌環(huán)境下對小鼠腹腔穿刺，注入5Ml無菌PBS，按摩腹部1min，沿腹中線剪開皮膚，暴露腹膜，小心抽出腹腔灌洗液（如出現(xiàn)血管破裂需裂解紅細(xì)胞），離心棄上清液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/ml加入到培養(yǎng)體系中（含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 U/Ml、鏈霉素100mg/L、小鼠重組IL?3和SCF各20μg/L），接種于培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每7天收集懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在培養(yǎng)第2周時收集部分細(xì)胞，對其進行形態(tài)及功能鑒定，其他細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直至開始凋亡。

2.小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞（bone marrow?derivedmast cells，BMMC）分離培養(yǎng)：脫頸椎處死小鼠后，無菌環(huán)境下分離小鼠雙側(cè)股骨，盡量剔除肌肉組織，剪斷兩端骨骺，用1Ml注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔收集細(xì)胞懸液，100μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾后離心，棄上清液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/Ml加入到培養(yǎng)體系中（含RPMI 1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素100 U/Ml、鏈霉素100mg/L、小鼠重組IL?3和SCF各10μg/L），接種于培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每7天收集懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板中培養(yǎng)，在培養(yǎng)第4周時收集部分細(xì)胞，對其進行形態(tài)及功能鑒定，其他細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)直至開始凋亡。

3.肥大細(xì)胞鑒定：

（1）甲苯胺藍染色：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC滴到多聚賴氨酸包被的載玻片上，風(fēng)干，加入1%pH7.4的甲苯胺藍染液靜置約30 s，用95%乙醇分色，三蒸水洗滌，光鏡下觀察。

（2）流式細(xì)胞儀檢測：分別收集培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度至1× 106/ml，每管取100μl，單染管分別加入0.5μl PE?CD117及0.2 μl FITC?FcεRⅠα，雙染管同時加入兩種抗體，空白管不加抗體，4℃避光孵育30min，PBS洗2次，上機檢測。

4.脫顆粒功能檢測：

（1）肥大細(xì)胞脫顆粒率測定：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC以5×105/ml鋪于12孔板（1ml/孔），分別加入0（空白對照）、1、10、100、1 000 mg/L的Compound48/80刺激1 h，收集細(xì)胞懸液進行甲苯胺藍染色，每張玻片鏡下計數(shù)1 000個肥大細(xì)胞。肥大細(xì)胞脫顆粒率=脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%

（2）肥大細(xì)胞β己糖胺酶釋放率測定：將培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC以5×105/Ml鋪于12孔板（1 ml/孔），分別加入0（空白對照）、10、100mg/LCompound48/80刺激1 h，離心，分別收集細(xì)胞沉淀及上清液。將上清液轉(zhuǎn)入96孔板，80μl/孔，每孔加入80μl反應(yīng)緩沖液（含40mmol/L檸檬酸，2mmol/L 4-硝基苯-N-乙?；?β-D-氨基葡萄糖，pH4.5）37℃孵育 1.5 h，加入 60μl終止反應(yīng)液（0.4mol/L甘氨酸，pH10.7），立即于405 nm處測量吸光度（A值）。用1Ml裂解液（含0.5%Triton X?100）冰浴裂解細(xì)胞沉淀10min，離心取上清液，其余步驟和上清液處理方式相同。β己糖胺酶釋放率=上清液A405值/（上清液A405值+胞內(nèi)A405值）×100%。

5.統(tǒng)計學(xué)分析：用GraphPad軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

PMC培養(yǎng)24 h及BMMC培養(yǎng)48 h時出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，呈梭形及類圓形，可見大小不等懸浮細(xì)胞。隨培養(yǎng)時間延長，懸浮細(xì)胞逐漸增多，貼壁細(xì)胞逐漸減少。PMC培養(yǎng)2周及BMMC培養(yǎng)4周時貼壁細(xì)胞基本消失，懸浮細(xì)胞形態(tài)、大小、分布趨于一致且折光性良好，表現(xiàn)為大小相近、向中央聚集的類圓形細(xì)胞，高倍鏡下可見胞膜上絲狀突起，偶可見處于自發(fā)脫顆粒狀態(tài)的不規(guī)則細(xì)胞。一般于培養(yǎng)10周后細(xì)胞開始凋亡。見圖1。

圖1 光鏡下不同誘導(dǎo)時期肥大細(xì)胞形態(tài)（×400） 1A：小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞（BMMC）培養(yǎng)第7天，細(xì)胞大小形態(tài)不一，存在較多貼壁細(xì)胞；1B：BMMC培養(yǎng)第4周，貼壁細(xì)胞消失，可見大小形態(tài)相近的類圓形懸浮細(xì)胞；1C：小鼠腹腔源性肥大細(xì)胞（PMC）培養(yǎng)第3天，可見類圓形懸浮細(xì)胞及梭形貼壁細(xì)胞；1D：PMC培養(yǎng)第2周，貼壁細(xì)胞消失，懸浮細(xì)胞大小形態(tài)趨于一致

二、肥大細(xì)胞成熟度

對培養(yǎng)2周的PMC及培養(yǎng)4周的BMMC行甲苯胺藍染色，可見細(xì)胞核呈藍色，胞質(zhì)內(nèi)含紫紅色異染顆粒的細(xì)胞數(shù)達95%以上，證實所獲得的細(xì)胞為成熟肥大細(xì)胞（圖2）。

圖2 肥大細(xì)胞甲苯胺藍染色（×400）

三、肥大細(xì)胞表面CD117及FcεRⅠα分子表達

培養(yǎng)2周的PMC（n=8）及培養(yǎng)4周的BMMC（n=12）CD117單陽性率分別為97.00%±1.21%及98.43%±0.22%，F(xiàn)cεRⅠα單陽性率分別為98.56%±0.47%及95.86%±0.70%，雙陽性率分別為97.68%±0.80%及96.12%±0.76%，兩種細(xì)胞雙陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.366，P ＞0.05）。見圖3。

四、肥大細(xì)胞脫顆粒率

Compound48/80刺激1 h后，培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC的脫顆粒率在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.382、29.887，均P＜0.001）。1、10、100、1 000μg/mlCompound48/80均可增加培養(yǎng)4周BMMC及培養(yǎng)2周PMC脫顆粒率，其中100mg/L和1000mg/L劑量組與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

五、肥大細(xì)胞β己糖胺酶釋放率

Compound48/80作用1 h后，培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC的β己糖胺酶釋放率在各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=40.013、66.991，均P＜0.001）。10mg/L和100mg/LCompound48/80均可增加兩種細(xì)胞β己糖胺酶釋放率，與空白對照組比較，100mg/L劑量組BMMC（P ＜ 0.000 1）以及10mg/L、100mg/L劑量組PMC（P ＜0.05、0.000 1）β己糖胺酶釋放率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

討 論

肥大細(xì)胞起源于骨髓造血干細(xì)胞，遷移至組織定植前為未成熟狀態(tài)，組織環(huán)境是其分化成熟的必要條件。根據(jù)定居組織位置不同，肥大細(xì)胞分為結(jié)締組織型肥大細(xì)胞和黏膜型肥大細(xì)胞。不同類型肥大細(xì)胞的生物學(xué)特性及功能不盡相同［3?4］。肥大細(xì)胞是蕁麻疹、血管性水腫等皮膚病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，在肥大細(xì)胞增生癥、特應(yīng)性皮炎、銀屑病、類天皰瘡、皮膚念珠菌病等多種皮膚病中也發(fā)揮重要作用。由于人原代肥大細(xì)胞培養(yǎng)仍是難題，獲得不同類型鼠源肥大細(xì)胞將有助于深入研究肥大細(xì)胞在這些皮膚病中的發(fā)病機制，并對其治療提供新的選擇。本文介紹了小鼠骨髓與腹腔來源肥大細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法。該方法克服了密度梯度離心法、磁珠分離法、流式分選法等傳統(tǒng)方法獲得的細(xì)胞數(shù)量少、純度低、成本高的缺陷［5］，分別由未成熟肥大細(xì)胞前體和結(jié)締組織型肥大細(xì)胞誘導(dǎo)分化增殖，在較短時間內(nèi)可獲得大量兩種不同類型高純度成熟肥大細(xì)胞。肥大細(xì)胞在培養(yǎng)時呈懸浮生長，我們在原代培養(yǎng)過程中通過不斷傳代，逐漸剔除貼壁細(xì)胞，由于PMC及BMMC分別在培養(yǎng)2周及4周時，貼壁細(xì)胞基本消失，故選擇該時間節(jié)點收集懸浮細(xì)胞進行后續(xù)鑒定。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測肥大細(xì)胞表面CD117及FcεRⅠα分子表達 3A～3D：培養(yǎng)4周小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞；3E～3H：培養(yǎng)2周腹腔源性肥大細(xì)胞

表1 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC脫顆粒率的影響（%±s）

表1 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC脫顆粒率的影響（%±s）

注：n=6。與空白對照組比較，a P＜0.01，b P＜0.001，c P＜0.000 1。BMMC：小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞，PMC：小鼠腹腔源性肥大細(xì)胞

Compound48/80濃度0（空白對照組）1mg/L 10mg/L 100mg/L 1 000mg/L F值P值4周BMMC 14.33±8.25 21.33±9.26 36.67±6.12 84.00±5.57a 93.67±0.88b 29.887＜0.001 2周PMC 12.60±4.71 24.40±5.99 31.40±7.74 74.00±5.30c 89.20±2.60c 36.382＜0.001

表2 不同濃度Compound48/80刺激對PMMC及PMC β己糖胺酶釋放率的影響（%±s）

注：n=6。與空白對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.000 1。BMMC：小鼠骨髓源性肥大細(xì)胞，PMC：小鼠腹腔源性肥大細(xì)胞

Compound48/80濃度0（空白對照組）10mg/L 100mg/L F值P值4周BMMC 15.56±2.79 19.42±3.93 64.32±3.11b 66.991＜0.001 2周PMC 13.89±2.70 30.96±5.01a 59.54±2.73b 40.013＜0.001

IL?3又稱多集落刺激因子或肥大細(xì)胞生長因子，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞生長、分化、遷移和效應(yīng)的重要細(xì)胞因子。它主要由活化T細(xì)胞、天然殺傷（NK）細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，并且支持SCF對肥大細(xì)胞前體的生長、分化、擴增的促進作用［6?7］。CD117（c?kit）是SCF的配體，除存在于肥大細(xì)胞表面外，還廣泛表達于各種造血祖細(xì)胞、淋巴祖細(xì)胞、黑素細(xì)胞、某些干細(xì)胞等。成熟肥大細(xì)胞表達大量高親和力IgE受體FcεRⅠα，驅(qū)動IgE介導(dǎo)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。但FcεRⅠα還表達于嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞等表面，只有肥大細(xì)胞同時表達CD117和FcεRⅠα［8］。成熟肥大細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)充滿強嗜堿性顆粒，顆粒內(nèi)含有組胺、5羥色胺、肝素等介質(zhì)。甲苯胺藍可使組胺、肝素等物質(zhì)呈異染性紫紅色，細(xì)胞核呈藍色，因此常用于肥大細(xì)胞的識別和鑒定［9］。故本研究通過甲苯胺藍染色及細(xì)胞表面CD117和FcεRⅠα的表達鑒定來評估肥大細(xì)胞純度和成熟度，結(jié)果顯示IL?3和SCF誘導(dǎo)培養(yǎng)2周及4周后小鼠腹腔及骨髓來源肥大細(xì)胞甲苯胺藍染色陽性率及共表達CD117和FcεRⅠα的比例均達到95%以上，且PMC和BMMC同時表達CD117和FcεRⅠα的雙陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

肥大細(xì)胞脫顆粒是肥大細(xì)胞區(qū)別于其他細(xì)胞的一種特異性功能狀態(tài)，在速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中是肥大細(xì)胞活化的重要標(biāo)志，因此有必要對誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的小鼠骨髓及腹腔來源肥大細(xì)胞進行脫顆粒功能評估。Compound48/80是一種常用促肥大細(xì)胞脫顆粒人工合成化合物［10］。組胺、類胰蛋白酶、β己糖胺酶常被用作定量測定肥大細(xì)胞脫顆粒水平的生物標(biāo)志物。組胺由于相對分子質(zhì)量小、無免疫原性、生理狀態(tài)下半衰期短，較類胰蛋白酶及β己糖胺酶檢測結(jié)果重復(fù)性差［11?12］。本研究利用鏡下計數(shù)肥大細(xì)胞脫顆粒率及定量測定β己糖胺酶釋放率兩種方法，檢測不同濃度Compound48/80刺激后小鼠骨髓及腹腔來源肥大細(xì)胞的脫顆粒水平，結(jié)果顯示，Compound48/80可促進培養(yǎng)2周PMC及培養(yǎng)4周BMMC脫顆粒。與培養(yǎng)4周BMMC相比，較低濃度Compound48/80即可使培養(yǎng)2周的PMCβ己糖胺酶釋放率顯著提高，提示培養(yǎng)2周PMC較培養(yǎng)4周BMMC對Compound48/80更敏感。這一結(jié)論需要進一步測定肥大細(xì)胞脫顆粒的其他代表性生物標(biāo)志物加以驗證。

綜上，本研究通過形態(tài)學(xué)及功能學(xué)兩方面鑒定誘導(dǎo)培養(yǎng)的小鼠腹腔及骨髓來源肥大細(xì)胞，證實獲得細(xì)胞具有成熟肥大細(xì)胞的生物學(xué)特性及功能，使后續(xù)基礎(chǔ)及臨床研究成為可能。