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(北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心/玉米 DNA 指紋及分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100097)

玉米是世界上最重要的糧食作物之一，提高玉米產(chǎn)量和改良玉米品質(zhì)，一直是全世界玉米育種工作者研究的重要課題。發(fā)展至今，我國(guó)玉米種植面積和總產(chǎn)量?jī)H次于美國(guó)，居世界第 2 位,2015年種植面積達(dá)到0.38 億hm2，總產(chǎn)達(dá)到2.24億t，面積和總產(chǎn)均列農(nóng)作物第1位，玉米成為中國(guó)第一大作物[1]。在玉米單產(chǎn)增長(zhǎng)的諸因素中，遺傳改良的作用占35%～40%[2]。玉米是利用雜種優(yōu)勢(shì)最早并且取得成效最顯著、也是種子市場(chǎng)價(jià)值最高的作物之一。優(yōu)異豐富的玉米種質(zhì)資源是玉米品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)。對(duì)我國(guó)玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)分析表明，種質(zhì)相對(duì)高度集中，遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄[3-4]，增加了玉米品種遭受病蟲(chóng)侵害的風(fēng)險(xiǎn)性，相近的親緣關(guān)系使其基因利用潛力受到限制，成為產(chǎn)量提高、品質(zhì)改善以及抗性增強(qiáng)的主要障礙[5]。實(shí)踐表明，玉米的種質(zhì)創(chuàng)新對(duì)玉米突破性新品種培育起到了巨大的支撐作用[6]，如著名的拉美玉米計(jì)劃(LAMP)和美國(guó)玉米種質(zhì)創(chuàng)新計(jì)劃(GEM)。國(guó)際玉米小麥改良中心(CIMMYT)貫徹“通過(guò)利用保存資源”的理念，構(gòu)建具有不同目的(熟期、籽粒顏色、籽粒類(lèi)型等)的廣基群體，應(yīng)用改良穗行半同胞方法進(jìn)行改良，再應(yīng)用相互輪回選擇等方法提高一般配合力[7]，開(kāi)展玉米種質(zhì)創(chuàng)新。

玉米在長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇下演化出多樣的生理種族和生態(tài)群，構(gòu)成了豐富的遺傳多樣性寶庫(kù)。利用熱帶亞熱帶種質(zhì)改良和拓寬現(xiàn)有種質(zhì)基礎(chǔ)已是世界各國(guó)玉米育種者的共識(shí)[5]。熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)來(lái)自于玉米多樣性中心，具有不同于溫帶種質(zhì)的遺傳變異，表現(xiàn)出根系發(fā)達(dá)、莖稈堅(jiān)韌、葉片濃綠、持綠期長(zhǎng)、多數(shù)對(duì)病蟲(chóng)害具有較強(qiáng)抗性，一些種質(zhì)抗倒伏和耐旱性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8]，與溫帶種質(zhì)遺傳差異大，多數(shù)表現(xiàn)出較高的雜種優(yōu)勢(shì)[9]。但由于熱帶、亞熱帶玉米類(lèi)型一般都具有很強(qiáng)的光敏感(周期)反應(yīng)，在溫帶地區(qū)表現(xiàn)抽雄吐絲延遲、雌雄不協(xié)調(diào)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、植株高大、空桿率高、結(jié)實(shí)率差，有些甚至不能開(kāi)花結(jié)實(shí)進(jìn)行繁殖，難以直接利用[10]。為此，開(kāi)展了利用和導(dǎo)入熱帶亞熱帶種質(zhì)的方法研究，提出了在相似生態(tài)環(huán)境直接利用、在過(guò)渡地區(qū)選擇逐步馴化或者溫帶地區(qū)混合選擇、采用單交、三交、回交和復(fù)合雜交等多種方法將熱帶、亞熱帶種質(zhì)導(dǎo)入到溫帶種質(zhì)、構(gòu)建溫帶熱帶復(fù)合群體進(jìn)行相互輪回選擇等利用途徑[4,11-12]，利用選育了一批優(yōu)良自交系，并用這些自交系配制了一批優(yōu)良雜交種，在各地推廣應(yīng)用。這些方法馴化過(guò)程緩慢，需要時(shí)間長(zhǎng)，且無(wú)法完全排除供體的殘余種質(zhì)、效率較低。因此，亟需一種快速鈍化熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)光敏性的方法，獲得在溫帶地區(qū)可以使用的玉米新種質(zhì)。

玉米DH(Doubled Haploid)育種技術(shù)作為現(xiàn)代玉米育種三大核心技術(shù)之一[13-14]，以生物雜交誘導(dǎo)獲得受體(基礎(chǔ)材料)材料的單倍體，經(jīng)過(guò)自然或人工處理使單倍體染色體加倍，2個(gè)世代就獲得遺傳上純合的自交系(DH系)，將自交系選育周期由7～8代縮短為2代，大幅度縮短育種年限，提高育種效率，已經(jīng)得到國(guó)內(nèi)外種業(yè)公司的規(guī)模化應(yīng)用。

依據(jù)玉米熱帶亞熱帶種質(zhì)利用實(shí)踐情況，結(jié)合DH育種技術(shù)，進(jìn)行了快速鈍化熱帶、亞熱帶光敏性的方法進(jìn)行研究，得到了一種結(jié)合冬季南繁和DH育種技術(shù)、經(jīng)南北不同區(qū)域種植、2年4個(gè)世代就可以將熱帶亞熱帶種質(zhì)導(dǎo)入溫帶種質(zhì)進(jìn)行利用的方法(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?0171038579.1)，實(shí)踐證明此方法切實(shí)可行有效。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用玉米自交系材料PH 4 CV為受體，以玉米熱帶種質(zhì)材料Suwan 1為供體。

1.2 試驗(yàn)方法

2009年10月在海南種植受體材料PH 4 CV 和熱帶種質(zhì)Suwan 1，組配雜交種子F1。成熟收獲后，混合脫粒，作為選系基礎(chǔ)材料。

2010年5月在北京以4 000株/667 m2的密度種植F1作為受體材料，并種植玉米單倍體誘導(dǎo)系京科誘044作為父本進(jìn)行雜交。為保證花期相遇，誘導(dǎo)系分二期種植。成熟后，收獲雜交果穗，并依據(jù)籽粒胚和胚乳頂端紫色標(biāo)記甄別，挑選出籽粒頂端紫色、胚無(wú)色籽粒為擬單倍體籽粒。

2010年10月在海南將擬單倍體籽粒單粒播種，拔節(jié)后依據(jù)植株顏色、長(zhǎng)勢(shì)等淘汰雜合植株，開(kāi)花期及時(shí)認(rèn)真檢查單倍體植株花藥顯露和花粉散粉情況，進(jìn)行自交，成熟后及時(shí)收獲結(jié)實(shí)果穗(DH系)。

2011年5月在北京種植DH純系進(jìn)行鑒定與擴(kuò)繁。將倒伏10%以上以及產(chǎn)生光敏反應(yīng)的開(kāi)花延遲、雌雄不調(diào)、不能自交的純系淘汰，及時(shí)自交。成熟后，再將有大斑病、小斑病、莖腐病、穗腐病等嚴(yán)重病害以及結(jié)實(shí)性極差(小于50粒)的純系淘汰，收獲自交結(jié)實(shí)50粒以上的DH純系。

2011年10月在海南種植DH純系，幼苗期利用DNA分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)進(jìn)行純合度鑒定，建立DNA指紋圖譜，分析DH純系與現(xiàn)有骨干自交系的遺傳距離和雜優(yōu)類(lèi)群，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)繁，用自交系PH 6 WC進(jìn)行測(cè)配。

2012年5月，將組配雜交組合種植在黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、北京、山西、河北、河南、山東、陜西等不同生態(tài)區(qū)進(jìn)行鑒定。選擇對(duì)莖腐病、穗粒腐病、大斑病、小斑病等主要病害達(dá)到中抗以上級(jí)別抗性、倒伏率低于10%、空桿率為3%以下、產(chǎn)量高于對(duì)照等綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的雜交組合，其對(duì)應(yīng)的DH系即為含有熱帶種質(zhì)能在溫帶利用的新種質(zhì)。

表1 含熱帶種質(zhì)的玉米優(yōu)良DH系測(cè)配組合表現(xiàn)情況(2012年)

組合地點(diǎn)小區(qū)產(chǎn)量(kg)比相鄰對(duì)照增產(chǎn)(%)PH6WC×H121919小湯山8.0212.4鐵嶺10.1715.6梨樹(shù)9.6812.8鄭州7.588.9PH6WC×H121949小湯山7.6310.3鐵嶺9.7812.2梨樹(shù)8.4911.8鄭州7.769.5PH6WC×H122005小湯山7.467.8鐵嶺8.238.6梨樹(shù)7.256.3鄭州6.625.8

2 結(jié)果與分析

2.1 快速創(chuàng)制含有玉米熱帶亞熱帶種質(zhì)DH系

2009年冬季獲得PH 4 CV×Suwan 1雜交組合，2010年春季種植作為基礎(chǔ)材料，以誘導(dǎo)系京科誘044雜交誘導(dǎo)，通過(guò)籽粒標(biāo)記鑒別獲得擬單倍體籽粒1 100粒，2010年冬季在海南種植鑒定，經(jīng)自然加倍獲得加倍DH系112份。2011年春季在北京種植鑒定與擴(kuò)繁，淘汰產(chǎn)生光敏反應(yīng)的開(kāi)花延遲、雌雄不調(diào)、不能自交、嚴(yán)重病害、結(jié)實(shí)性差的純系，收獲優(yōu)良DH純系20份。2011年冬季在海南種植20份DH系，幼苗期提取葉片DNA，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行純合度鑒定，建立DNA指紋圖譜，分析DH純系與現(xiàn)有骨干自交系的遺傳距離和雜優(yōu)類(lèi)群，用自交系PH 6 WC進(jìn)行測(cè)配。2012年春、夏季將組配雜交組合種植在黑龍江、遼寧、吉林、內(nèi)蒙古、北京、山西、河北、河南、山東、陜西等進(jìn)行鑒定。結(jié)合田間表現(xiàn)和抗性調(diào)查，鑒定篩選出產(chǎn)量高于對(duì)照等綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的雜交組合PH 6 WC×H 121919、PH 6 WC×H 121949、PH 6 WC×H 122005(見(jiàn)表1)，其對(duì)應(yīng)的純系定名為京SV 19、京SV 49、京SV 05，為含有熱帶種質(zhì)能在溫帶利用的新種質(zhì)(圖1)。

圖1 導(dǎo)入熱帶種質(zhì)的玉米DH系植株(京SV 19和京SV 49單株與群體)

圖2 第二輪含有熱帶種質(zhì)玉米DH系(果穗)

通過(guò)南北不同區(qū)域種植，從構(gòu)建基礎(chǔ)材料到得到DH系僅用了2年4個(gè)世代，而且得到的DH系含有熱帶亞熱帶種質(zhì)，可以直接用于玉米新品種育種，或者作為新材料加入到玉米育種項(xiàng)目中。京SV 19、京SV 49已經(jīng)申請(qǐng)植物新品種權(quán) (申請(qǐng)?zhí)柗謩e為20160068.7、 20160069.6，見(jiàn)圖1)。

2.2 含有熱帶亞熱帶種質(zhì)DH系的利用

為充分挖掘新種質(zhì)京SV 19、京SV 49、京SV 05配合力特性與利用潛力，于2013年、2014年與多個(gè)自交系進(jìn)行大范圍測(cè)定與鑒定，篩選優(yōu)良雜交組合。其中選用雜交組合京X 005×京SV 19(京科青貯649)參加了2015年北京春播青貯玉米試驗(yàn)，結(jié)果平均生物產(chǎn)量為1 432 kg/667 m2，比對(duì)照農(nóng)大108增產(chǎn)4.5%，且纖維品質(zhì)一級(jí)，具有較高的穩(wěn)產(chǎn)性和抗倒伏能力，并被推薦參加國(guó)家2016年青貯玉米區(qū)試，申報(bào)并獲得植物新品種權(quán)(CNA 20150630.7)。在黃淮海區(qū)域試驗(yàn)中，2016年遇到高溫，部分試驗(yàn)地點(diǎn)出現(xiàn)空桿，該組合沒(méi)有晉級(jí)試驗(yàn)。

針對(duì)現(xiàn)有雜交組合存在不足，確定將不同新種質(zhì)攜帶的優(yōu)良基因進(jìn)行聚合，為此，2015年春季在北京將京SV 19與京SV 49進(jìn)行雜交獲得雜交種子，2015年冬季在海南對(duì)雜交F1進(jìn)行誘導(dǎo)獲得單倍體籽粒，2016年春季在張掖種植加倍獲得DH系162個(gè)(第二輪含有熱帶亞熱帶種質(zhì)的玉米DH系)，并于2016冬季在海南進(jìn)行擴(kuò)繁鑒定與測(cè)配，2017年春夏季對(duì)測(cè)配組合進(jìn)行多點(diǎn)種植鑒定。經(jīng)田間調(diào)查與收獲測(cè)產(chǎn)相結(jié)合，篩選出30多個(gè)優(yōu)良組合，這些組合所對(duì)應(yīng)的優(yōu)良新DH系10多個(gè)，如B 160957、B 163200、B 163211、B 163333、B 163462、B 163478、B 163501、B 163666等(圖2)。這批玉米DH系含有熱帶種質(zhì)，在溫帶地區(qū)種質(zhì)完全沒(méi)有光敏反應(yīng)，植株中等，抗倒性強(qiáng)，持綠性好，果穗結(jié)實(shí)性好，將用于組配選育新組合，或與溫帶骨干自交系雜交組建基礎(chǔ)材料進(jìn)行自交系選育。

3 討論與結(jié)論

熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)與溫帶玉米種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)差異較大，利用熱帶、亞熱帶玉米種質(zhì)不但可以增強(qiáng)溫帶玉米種質(zhì)在抗病、抗逆、優(yōu)良農(nóng)藝性狀等方面的特性，還可以拓寬溫帶玉米種質(zhì)的遺傳多樣性。引進(jìn)熱帶、亞熱帶種質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行鑒定、改良，拓寬我國(guó)玉米種質(zhì)基礎(chǔ)是育種者的共識(shí)，并得到實(shí)施取得不少成效[11]。在具體利用方式和途徑方面做了很多研究，提出了不少方法、途徑，但均表明熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)利用是一個(gè)需要長(zhǎng)時(shí)間的緩慢過(guò)程[4，11，15]。

隨著細(xì)胞工程技術(shù)、染色體技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因編輯等現(xiàn)代技術(shù)的出現(xiàn)與應(yīng)用，常規(guī)育種技術(shù)得到補(bǔ)充，育種效率將顯著提高。玉米生物雜交誘導(dǎo)DH 育種技術(shù)以其特有優(yōu)勢(shì)已經(jīng)得到規(guī)?；瘧?yīng)用[14]。本研究以溫帶玉米材料為受體、熱帶種質(zhì)為供體，開(kāi)展快速鈍化熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)光敏性研究。結(jié)果表明，以溫?zé)犭s交組合作為基礎(chǔ)材料，利用冬季南繁，結(jié)合玉米DH 育種技術(shù)，經(jīng)南北不同區(qū)域、2年4個(gè)世代就得到在溫帶地區(qū)可以種植利用的含有熱帶亞熱帶種質(zhì)的玉米DH系，既可以直接進(jìn)行優(yōu)良玉米新品種選育，也可以作為新材料加入到原有玉米種質(zhì)材料，拓寬玉米種質(zhì)基礎(chǔ)，選育新的優(yōu)良自交系。此方法解決了快速鈍化熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)光敏性的問(wèn)題，切實(shí)可行有效，將加快我國(guó)熱帶亞熱帶玉米種質(zhì)的利用進(jìn)程。