張文穎，王晨，朱旭東，馬超，王文然，冷翔鵬，鄭婷，房經(jīng)貴

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葡萄全基因組DELLA蛋白基因家族鑒定及其應(yīng)答外源 赤霉素調(diào)控葡萄果實發(fā)育的特征

張文穎1，王晨1，朱旭東1，馬超2，王文然1，冷翔鵬3，鄭婷1，房經(jīng)貴1

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109）

【目的】明確DELLA蛋白基因在葡萄基因組數(shù)據(jù)庫中的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和組織表達(dá)差異，探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素（GA）信號傳導(dǎo)及葡萄無核果實發(fā)育機(jī)理中的作用機(jī)制?！痉椒ā炕跀M南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因，利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鑒定葡萄基因組中的DELLA蛋白基因；以‘白羅莎里奧’葡萄品種為試材，采用PCR技術(shù)克隆3個DELLA蛋白基因的cDNA全長序列；通過啟動子作用元件分析預(yù)測其潛在功能；利用生物信息學(xué)軟件對其染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、理化特性、亞細(xì)胞定位及蛋白互作等進(jìn)行分析；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時表達(dá)技術(shù)分析DELLA蛋白的亞細(xì)胞定位情況；采用qRT-PCR方法檢測葡萄DELLA蛋白基因應(yīng)答GA在果皮、果肉、種子（或種子區(qū)）的時空表達(dá)特征?！窘Y(jié)果】鑒定得到3個葡萄DELLA蛋白基因，克隆并驗證其精確序列，分別命名為（VIT_201s0011g05260）、（VIT_214s0006g00640）及（VIT_211s0016g04630），其染色體定位、開放閱讀框（ORF）大小、編碼氨基酸數(shù)量分別為：Chr1、1 773 bp、590個；Chr14、1 710 bp、569個；Chr11、1 599 bp、532個?；蚪Y(jié)構(gòu)分析表明其DNA序列均無內(nèi)含子，只有1個外顯子，基因結(jié)構(gòu)高度保守。進(jìn)化分析顯示VvGAI1與VvRGA親緣關(guān)系較近，被聚類為一組，而VvSLR1為另一組。3個基因的啟動子均含有響應(yīng)赤霉素和胚乳發(fā)育相關(guān)的作用元件，表明它們可能參與響應(yīng)GA信號傳導(dǎo)和胚乳發(fā)育過程。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示3個DELLA蛋白均定位于細(xì)胞核。qRT-PCR結(jié)果顯示除果皮中在近成熟期具有表達(dá)高峰外，其余均在幼果期高表達(dá)，且外源GA處理均不同程度降低了3個DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和種子區(qū)的表達(dá)，尤以種子區(qū)下調(diào)水平最為顯著。蛋白互作分析表明3個DELLA蛋白均為葡萄GA信號傳導(dǎo)的核心作用元件，均可能與GIDI1和SLY1互作參與葡萄GA信號傳導(dǎo)?！窘Y(jié)論】葡萄基因組中含有3個DELLA蛋白基因家族成員；不同物種間DELLA蛋白結(jié)構(gòu)高度保守；GA可能通過負(fù)調(diào)控這3個成員參與葡萄果皮、果肉和種子區(qū)的發(fā)育，且3個成員均可能通過應(yīng)答GA信號調(diào)控葡萄無核果實的發(fā)育。

葡萄；DELLA；亞細(xì)胞定位；表達(dá)；互作；赤霉素

0 引言

【研究意義】赤霉素（gibberellic acid，GA）是植物生長發(fā)育必需的一類激素，在植物生命周期中的諸多時期都具有重要作用，如調(diào)控種子的萌發(fā)、莖及下胚軸的伸長、短枝和植株的矮化、葉片的延展、細(xì)胞膨大、表皮毛狀體的發(fā)育、控制開花時間及花果發(fā)育等多種生理和發(fā)育過程[1-3]。DELLA蛋白是GA信號傳導(dǎo)途徑的核心作用元件，對植物的生長發(fā)育起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[4-5]。目前，盡管擬南芥和水稻等模式植物已有較多的研究，但研究表明不同物種間DELLA蛋白基因成員數(shù)量存在一定的差異，其作用也有所不同[6-8]。葡萄是GA高度敏感的樹種，GA可高效誘導(dǎo)葡萄無核，且廣泛應(yīng)用于葡萄無核化生產(chǎn)[9-10]。鑒定葡萄基因組中DELLA蛋白基因家族成員及其應(yīng)答外源GA信號的時空表達(dá)規(guī)律，將有助于解析DELLA蛋白基因在葡萄無核果實發(fā)育過程中的作用機(jī)制，對更科學(xué)地調(diào)控葡萄果實的發(fā)育以及無核果實的生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】DELLA蛋白屬于GRAS核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族，是GRAS家族中研究最為廣泛的亞族之一[11]。N端具有高度保守的DELLA和TVHYNP酸性結(jié)構(gòu)域，并且該區(qū)域在亞族不同成員中有所變化[12]，中部有核定位信號結(jié)構(gòu)域（nuclear localization sequence， NLS），C端有類似SH2、RVER和SAW的結(jié)構(gòu)域。研究表明DELLA及TVHYNP結(jié)構(gòu)域可能是GA信號感知結(jié)構(gòu)域，C端的VHIID、SH2和SAW等結(jié)構(gòu)域可能是GA信號阻遏結(jié)構(gòu)域[13]。作為GA信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵抑制因子，當(dāng)無GA信號時，DELLA蛋白對植物的生長發(fā)育起抑制作用；在有GA的情況下，DELLA蛋白通過泛素化途徑降解，從而解除其阻遏作用[14]。此外，DELLA蛋白可通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子互作，調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而實現(xiàn)對多種植物激素信號的調(diào)節(jié)[15]。研究發(fā)現(xiàn)不同物種中DELLA蛋白基因家族成員數(shù)量存在差異，擬南芥含有5個DELLA蛋白基因家族成員（、、、及）[6]，而水稻中只有1個成員Os[11]，大麥中只有1個成員[16]。近年來，越來越多植物的DELLA蛋白基因被克隆[17]，但在葡萄方面，除筆者課題組前期做了初步的研究之外[18-19]，尚未見到關(guān)于DELLA蛋白基因家族系統(tǒng)的研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】基因組測序使葡萄基因組中DELLA蛋白基因成員的分離與鑒定成為可能，但葡萄DELLA蛋白成員的系統(tǒng)鑒定、進(jìn)化分析及GA介導(dǎo)DELLA蛋白調(diào)控葡萄果實發(fā)育的研究尚無相關(guān)報道，DELLA蛋白是否參與了葡萄無核果實的發(fā)育及其調(diào)控方式尚未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以葡萄全基因組為基礎(chǔ)，鑒定所有DELLA蛋白基因家族成員，克隆并驗證其精確序列，揭示其染色體定位、結(jié)構(gòu)特點、進(jìn)化特征、亞細(xì)胞定位、蛋白互作等信息，明確葡萄DELLA蛋白家族基因在果皮、果肉、種子區(qū)中的表達(dá)特征及其應(yīng)答外源GA的時空表達(dá)模式，為DELLA蛋白功能的解析和深入闡明赤霉素介導(dǎo)DELLA蛋白誘導(dǎo)葡萄無核的分子機(jī)理提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料處理

試驗于2017年5月1日至8月11日在江蘇句容農(nóng)博園試驗基地進(jìn)行，供試品種為6年生歐亞種葡萄‘白羅莎里奧’（‘Rosario Bianco’），供試植株常規(guī)管理且生長健壯，株行距1 m×2.5 m，雙十字V型架，避雨栽培。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，于花前10 d（2017年5月1日）用50 mg·L-1的GA3浸蘸葡萄花序30 s，清水處理為對照。每組處理選定12株長勢較為一致的植株，每4株為1個重復(fù)，共設(shè)3次重復(fù)。分別于幼果期（花后10 d，5月28日）、硬核期（花后35 d，6月22日）、第2次膨大期（花后60 d，7月17日）、近成熟期（花后85 d，8月11日）4個果實發(fā)育時期采集葡萄果實樣品，采集后的樣品一半用于生理指標(biāo)測定及體式顯微鏡觀察等，另一半將果皮、果肉、種子區(qū)分別凍樣，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Prime ScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶、DNase酶Ⅰ、Ex-酶、dNTPs、DNA Marker，熒光定量染料SYBR GreenⅠ均購自TaKaRa公司。各種引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其編號及序列見表1。

表1 引物序列及用途

下劃線部分和分別為添加Ⅰ和Ⅰ酶切位點

The underlined sequencesandin the primers represent restriction enzyme sites ofⅠandⅠ, respectively

1.2 葡萄DELLA蛋白基因家族成員的鑒定

DELLA基因相關(guān)蛋白序列都包含GRAS和DELLA結(jié)構(gòu)域，利用HMMER程序，以PFAM（http:/ /pfam.sanger.ac.uk）上的種子文件（GRAS: PF03514，DELLA: PF12041）為檢索矩陣，檢索葡萄CRIBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http://genomes.cribi.unipd.it/grape/index. php），同時利用NCBI的CDD程序（http://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）檢查葡萄假定的DELLA相關(guān)基因結(jié)構(gòu)域，對候選基因進(jìn)一步確認(rèn)，存在GRAS及DELLA結(jié)構(gòu)域的蛋白序列屬于DELLA蛋白家族。

1.3 總RNA的提取及cDNA的合成

采用筆者實驗室改良的CTAB法[20]提取GA3處理與對照4個不同果實發(fā)育時期果皮、果肉及種子區(qū)的總RNA。cDNA的合成以提取的總RNA為模板，參考TaKaRa Prime ScriptTMRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.4 葡萄DELLA蛋白基因家族成員的克隆

以葡萄果皮的cDNA為模板，用相應(yīng)引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，10×PCR buffer（Mg2+plus）5 μL，dNTP Mixture 4 μL，Ex-酶0.50 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。4℃下保存。產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的片段，連接至pMD19T載體進(jìn)行TA克隆，DNA測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.5 葡萄DELLA蛋白基因家族的生物信息學(xué)分析

葡萄DELLA家族基因內(nèi)含子、外顯子和基因組定位信息均來自于葡萄基因組數(shù)據(jù)庫CRIBI（http:// genomes.cribi.unipd.it/grape/index.php），染色體定位圖運用MapInspect軟件繪制；核苷酸及氨基酸序列利用NCBI的BLASTn和BLASTp（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源比對，使用MEGA 7.0.21軟件，選用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，校驗參數(shù)為Bootstrap=1 000；利用在線工具M(jìn)EME（http://meme-suite.org/tools/meme）鑒定蛋白保守基序，其參數(shù)設(shè)置基序數(shù)量10個，其余參數(shù)在默認(rèn)條件下；利用本地軟件Clustal X 2.1、DNAMAN 6.0及在線軟件WebLogo 2.82（http://weblogo.berkeley.edu/ logo.cgi）進(jìn)行蛋白多序列比對；利用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）繪制基因結(jié)構(gòu)示意圖；采用在線數(shù)據(jù)庫（CDD，https//www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的分析；采用WoLF PSORT（http://www.genscript.com/ wolf-psort.html）在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用在線軟件PRABI（http://www.prabi.fr/）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；根據(jù)在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析。利用STRING（https://string-db.org/）在線軟件進(jìn)行蛋白互作分析。

1.6 啟動子順式作用元件分析

從葡萄基因組中找出DELLA蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始位置（ATG）上游1 500 bp的序列，參考Fan等[21]的方法，利用PlantCARE在線數(shù)據(jù)庫（http//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/），進(jìn)行啟動子順式作用元件分析。

1.7 DELLA蛋白亞細(xì)胞定位載體的構(gòu)建和定位分析

根據(jù)3個DELLA蛋白基因的ORF序列（去除終止密碼子）設(shè)計分別含有I、I 酶切位點的引物（表1），以DELLA蛋白基因完整的ORF區(qū)質(zhì)粒為模板，通過PCR引入I和Ⅰ酶切位點，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序確認(rèn)無任何突變后提取質(zhì)粒，利用I和Ⅰ進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接到pCAMBIA1302-GFP載體從而分別獲得、:及融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入DH5，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進(jìn)行測序驗證。

選取具有4片真葉的野生型本氏煙草用于農(nóng)桿菌侵染，參考楊占武等[22]的方法進(jìn)行目的蛋白在煙草中的瞬時表達(dá)。撕取侵染后的煙草葉片下表皮在激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP2，Leica，Germany）下觀察熒光蛋白的亞細(xì)胞定位情況并拍照。

1.8 DELLA蛋白基因表達(dá)特性分析

分別以4個不同發(fā)育時期葡萄果皮、果肉和種子區(qū)總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以為內(nèi)參基因，擴(kuò)增體系及程序根據(jù)TaKaRa公司的SYBR?TMⅡ試劑盒說明書進(jìn)行。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，所用引物見表1，采用2-ΔΔCt計算各基因的相對表達(dá)量，采用DPS 7.05軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計及差異顯著性分析（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 赤霉素處理對‘白羅莎里奧’葡萄果實生長發(fā)育的影響

GA3處理后，果實無核率達(dá)到92%，葡萄果?？v徑、果形指數(shù)明顯增加（圖1-A），穗長、軸粗明顯增加，但對果穗寬度的影響不大（圖1-B），且這些現(xiàn)象均顯著發(fā)生在幼果期（花后10 d）。該結(jié)果表明，赤霉素處理可明顯拉長果穗，加粗穗軸，且可高效誘導(dǎo)‘白羅莎里奧’葡萄無核化。

2.2 葡萄全基因組DELLA蛋白基因家族成員的鑒定及克隆驗證

利用生物信息學(xué)方法，從葡萄基因組中鑒定得到DELLA蛋白基因家族3個成員（VIT_ 201s0011g05260）、（VIT_214s0006g00640）及（VIT_211s0016g04630），染色體定位發(fā)現(xiàn)它們分別定位于chr1、chr11、chr14這3條不同的染色體（圖2-A）。根據(jù)預(yù)測結(jié)果的基因序列設(shè)計特異引物，以葡萄各時期果皮混合cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別克隆到3個含有完整ORF區(qū)的cDNA序列（圖2-B），且3個電泳條帶與預(yù)測的引物擴(kuò)增片段大小一致，證實預(yù)測的3個基因在葡萄中真實存在。測序結(jié)果表明片段長度為1 773 bp，編碼590個氨基酸；片段大小為1 710 bp，編碼569個氨基酸；片段長為1 599 bp，編碼532個氨基酸。

‘白羅莎里奧’葡萄生長發(fā)育的4個時期：10DAF：花后10 d；35DAT：花后35 d；60DAT：花后60 d；85DAT：花后85 d。圖9、圖10同

圖2 葡萄DELLA蛋白基因的染色體定位（A）及cDNA全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測圖（B）

2.3 DELLA蛋白基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 DELLA蛋白氨基酸序列分析 根據(jù)3個DELLA蛋白基因cDNA編碼的的氨基酸序列，分別與擬南芥、水稻、草莓、蘋果、桃、核桃、棗、櫻桃、甜瓜、番木瓜、番茄、蓮、棉花進(jìn)行同源比對。利用Clustal X 2.1和DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對，發(fā)現(xiàn)不同物種DELLA蛋白氨基酸序列含有典型的DELLA結(jié)構(gòu)域、TVHYNP結(jié)構(gòu)域、VHVID結(jié)構(gòu)域、RVER結(jié)構(gòu)域、SAW結(jié)構(gòu)域及核定位信號（NLS）（圖3）。但在一些物種的不同成員中部分結(jié)構(gòu)域有所變化，其中以DELLA結(jié)構(gòu)域的變化最大，如SLR1在葡萄、蓮、核桃、棉花、番木瓜、甜瓜中的DELLA結(jié)構(gòu)域為DGLLA，草莓FvGAI的DELLA結(jié)構(gòu)域也為DGLLA，表明DELLA蛋白家族在不同物種中的功能可能具有一定的多樣性。

2.3.2 葡萄DELLA蛋白系統(tǒng)發(fā)育及蛋白保守基序分析 利用MEGA 7.0.21對同源比對結(jié)果進(jìn)行進(jìn)化分析，由圖4-A可見，3個DELLA蛋白可被分為兩組，其中VvGAI1與VvRGA在同一組中的不同亞組，而VvSLR1在另一組。且VvGAI1與擬南芥AtGAI和蓮NnGAI1的親緣關(guān)系較近，VvRGA與棗ZjGAI的同源性較高，而VvSLR1與蓮NnSLR1的親緣關(guān)系最近，表明不同物種DELLA蛋白系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可能存在一定的差異。由圖4-B可知，各蛋白序列所包含的保守基序類型及數(shù)量雖有一定不同，但各類元件種類和數(shù)量總體較為固定，除核桃JrGAI1和JrGAI2N端不具有TVHYNP結(jié)構(gòu)域（元件8）外，其余N端均含有DELLA保守結(jié)構(gòu)域（元件7）、中部VHVID結(jié)構(gòu)域（元件8）、C端RVER（元件3）及SAW結(jié)構(gòu)域（元件6）（圖4-C），揭示了其功能的保守性。

2.3.3 葡萄DELLA蛋白基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 根據(jù)蛋白同源比對結(jié)果，對葡萄和其他物種的DELLA蛋白基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示不同物種間DELLA蛋白基因結(jié)構(gòu)高度保守，均含有1個外顯子，無內(nèi)含子（圖5-A）。對DELLA蛋白保守域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同物種間結(jié)構(gòu)域高度保守，Ｎ端均含有DELLA結(jié)構(gòu)域，C端含有GRAS結(jié)構(gòu)域（圖5-B），屬于GRAS家族基因。

NLS：氨基酸區(qū)域內(nèi)核定位信號；保守結(jié)構(gòu)域：DELLA、TVHYNP、VHVID、RVER、SAW

A：DELLA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析The phylogenetic relationships of DELLA proteins from various organisms；B：保守元件分布圖The conservative element distribution figure；C：具體的保守元件堿基The specific conservative element residues

圖5 DELLA蛋白基因結(jié)構(gòu)（A）及保守結(jié)構(gòu)域（B）預(yù)測

2.4 葡萄DELLA蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對葡萄DELLA蛋白二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，三者二級結(jié)構(gòu)均主要由-螺旋、-轉(zhuǎn)角形式組成，且均以-螺旋為主，-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)較少（圖6-A）。利用SWISS-MODEL進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源建模，結(jié)果表明其蛋白三維空間排列所形成的蛋白質(zhì)分子構(gòu)象具有多樣性（圖6-B），且VvRGA與VvSLR1的蛋白構(gòu)象更相似，表明其在某些方面可能具有相似的功能。

圖6 葡萄DELLA蛋白二級（A）三級結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測

2.5 葡萄DELLA蛋白基因啟動子作用元件分析

基因啟動子的作用元件分析可以預(yù)測基因的潛在功能，為認(rèn)識葡萄DELLA蛋白基因應(yīng)答各種反應(yīng)的潛在機(jī)制，本研究分析了它們啟動子的順式作用元件（圖7-A）。結(jié)果顯示，該家族的啟動子作用元件大致可分為5類：光信號響應(yīng)、激素相關(guān)響應(yīng)、脅迫相關(guān)響應(yīng)、組織特異性響應(yīng)和晝夜周期節(jié)律相關(guān)元件（圖7-A）。對比3個DELLA蛋白基因成員的作用元件發(fā)現(xiàn)，元件數(shù)量上，最多，其次是，而的元件數(shù)量最少。元件類型上，除不含有晝夜節(jié)律相關(guān)元件外，其余基因啟動子均含有上述5類作用元件，其中以光響應(yīng)元件數(shù)量最多，激素和組織特異性相關(guān)響應(yīng)元件的數(shù)量次之，其次是脅迫相關(guān)響應(yīng)元件，晝夜節(jié)律相關(guān)元件數(shù)量最少，且3個基因均含有胚乳發(fā)育相關(guān)的組織特異性元件。這些存在的調(diào)控元件說明葡萄DELLA蛋白基因家族成員不僅能夠響應(yīng)光、脅迫等外界環(huán)境信號，而且還能應(yīng)答激素的影響，可能通過參與植物體內(nèi)的生物學(xué)過程來共同調(diào)控葡萄無核果實的生長發(fā)育。

A：DELLA蛋白基因啟動子不同類型順式作用元件匯總The total number of diverse types of cis-elements derived from the DELLA protein gene promoters；B：DELLA蛋白基因激素相關(guān)順式作用元件Hormone-related cis-elements of DELLA protein genes

為進(jìn)一步認(rèn)識DELLA蛋白基因在葡萄中響應(yīng)激素的潛在作用，分析了與激素響應(yīng)有關(guān)的作用元件。如圖7-B所示，所有啟動子均含有激素相關(guān)響應(yīng)元件，主要包括GA、生長素（auxin，IAA）、水楊酸（salicylicacid，SA）及乙烯（ethylene，ET）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）等激素響應(yīng)元件，表明這3個成員能夠應(yīng)答多種激素信號參與調(diào)控葡萄生長發(fā)育。值得注意的是，3個DELLA基因的啟動子均具有響應(yīng)GA、SA、MeJA和ABA的作用元件，其中GA和SA是葡萄花和漿果發(fā)育的關(guān)鍵激素，特別是與葡萄無核果的發(fā)育相關(guān)[23-24]，表明DELLA蛋白基因可能通過響應(yīng)激素信號參與無核葡萄的發(fā)育過程。

2.6 葡萄DELLA蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明葡萄3個DELLA蛋白中VvGAI1、VvRGA集中分布在細(xì)胞核上，VvSLR1集中分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中（圖8-A）。構(gòu)建瞬時表達(dá)載體對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗證，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化空載體的GFP熒光信號分布在整個細(xì)胞，3個DELLA GFP的熒光信號主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，說明葡萄3個DELLA蛋白均定位在細(xì)胞核中（圖8-B）。

2.7 葡萄果實發(fā)育不同時期DELLA蛋白基因的時空表達(dá)特征

為認(rèn)識DELLA蛋白基因在葡萄果實發(fā)育過程中的調(diào)控作用，利用qRT-PCR技術(shù)分別分析了3個DELLA基因在4個發(fā)育不同時期葡萄果皮、果肉及種子區(qū)的時空表達(dá)特征。由圖9可看出，3個基因在不同組織不同時期的表達(dá)模式存在時空特異性，但總體看來與具有相似的表達(dá)模式，3個組織中均在幼果期（花后10 d）的表達(dá)量最高，在果實第2次膨大期（花后60 d）有較高表達(dá)，在其余2個時期低表達(dá)。與二者不同，在近成熟期（花后85 d）的果皮中具有表達(dá)高峰，在幼果期果肉與果核中的表達(dá)量也顯著高于其他時期，但在其他時期的果核中幾乎不表達(dá)，表明不同DELLA蛋白基因成員的作用方式不同。

圖8 葡萄DELLA蛋白亞細(xì)胞定位

A：果皮Berry pericarp；B：果肉Berry flesh；C：種子區(qū)Seed area。柱上不同字母表示差異顯著 Different letters on the bars indicate significant difference (P＜0.05)

2.8 DELLA蛋白基因在GA誘導(dǎo)葡萄無核果實發(fā)育過程中的表達(dá)模式

為進(jìn)一步認(rèn)識葡萄DELLA蛋白基因在果實不同組織的不同發(fā)育時期對外源GA的響應(yīng)模式，利用GA3處理和對照不同樣品的cDNA為模板，對DELLA蛋白基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示經(jīng)GA3處理后，3個葡萄DELLA蛋白基因在不同發(fā)育時期葡萄果皮、果肉和種子區(qū)的表達(dá)水平均低于對照（圖10），說明GA可通過抑制葡萄DELLA蛋白基因的表達(dá)參與調(diào)控葡萄果實的發(fā)育。進(jìn)一步對比分析發(fā)現(xiàn)，和在果皮、果肉和種子區(qū)中具有相似的應(yīng)答GA的表達(dá)模式，即它們在幼果期被GA顯著下調(diào)。而在果實的3個不同組織中展現(xiàn)出不同的應(yīng)答GA模式，在果皮中，僅在果實近成熟期被強(qiáng)烈抑制，而在果肉中的表達(dá)幾乎不受GA影響，但在幼果期種子區(qū)中的表達(dá)卻被GA顯著下調(diào)，下調(diào)程度超過了和，表明在葡萄種子區(qū)是DELLA蛋白家族中應(yīng)答GA的重要因子。

2.9 葡萄DELLA蛋白的互作

為探究葡萄中DELLA蛋白在GA信號途徑中的作用情況，對DELLA蛋白的互作情況進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄中3個DELLA蛋白基因均為GA信號傳導(dǎo)的核心作用因子（圖11-A）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)3個DELLA蛋白均可與3個蛋白有共表達(dá)（圖11-B），其中2個為F-box家族蛋白SLY1，主要起抑制DELLA蛋白的作用；一個為GA受體GID1，與DELLA蛋白具體的互作情況尚未明確（表2），有待進(jìn)一步試驗驗證。

表2 葡萄DELLA互作蛋白

A：果皮Berry pericarp；B：果肉Berry flesh；C：種子區(qū)Seed area。*代表差異顯著* indicates significant difference (P＜0.05)

3 討論

無核是葡萄極其重要的經(jīng)濟(jì)性狀，GA是誘導(dǎo)葡萄無核的關(guān)鍵激素[9-10,25]?！琢_莎里奧’葡萄對GA高度敏感，GA可高效誘導(dǎo)其無核，且為當(dāng)前葡萄生產(chǎn)中推廣的一個重要品種。結(jié)合品種特性與生產(chǎn)經(jīng)驗，筆者前期開展了GA3誘導(dǎo)該品種無核的預(yù)備試驗。于花前10 d，分別以25、50、75、100 mg·L-14個GA3濃度浸蘸葡萄花序，其中以50 mg·L-1的GA3處理誘導(dǎo)其無核的效果最佳，其無核率達(dá)到92%。本試驗通過GA3處理，同樣高效誘導(dǎo)了‘白羅莎里奧’葡萄果實無核化，顯著拉長了葡萄果穗，加粗了葡萄穗軸。

A：葡萄赤霉素信號傳導(dǎo)途徑，中間的6個基因為途徑中的核心作用元件Gibberellin signaling pathway in grape, the 6 genes in the middle are the core components of the pathway；B：每個DELLA蛋白的互作情況The interaction of each DELLA protein

作為GA信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的核內(nèi)負(fù)調(diào)控因子，DELLA蛋白基因家族成員的鑒定分析在擬南芥、水稻等模式植物中已有較多研究[26]，但研究表明不同物種中DELLA蛋白基因成員數(shù)量及作用方式不同。而葡萄作為GA高度敏感的樹種，只有楊光等[18]在‘藤稔’葡萄中初步克隆了DELLA蛋白基因家族的一個成員并將其命名為，而本研究從‘白羅莎里奧’中克隆得到葡萄DELLA蛋白基因家族的全部成員（3個），經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)本研究在‘白羅莎里奧’中的鑒定的序列與楊光等[18]報道的屬于不同葡萄品種中的同源序列，其序列一致，說明該基因在不同品種中具有高度的序列保守性。葡萄DELLA蛋白基因家族成員的數(shù)量少于擬南芥中的成員數(shù)量（5個）[6]，多于水稻和大麥（1個）[11,16]，這可能是由于不同物種中經(jīng)歷的基因復(fù)制事件次數(shù)不同[27]，從而導(dǎo)致不同物種中出現(xiàn)不同數(shù)量的DELLA蛋白基因。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，葡萄DELLA蛋白及其同源物種的進(jìn)化分析與基因結(jié)構(gòu)分析、蛋白保守基序分析結(jié)果較一致。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明DELLA蛋白在不同物種間高度保守，N端都具有保守的DELLA結(jié)構(gòu)域來響應(yīng)GA信號，C端具有GRAS結(jié)構(gòu)域參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[13]，但部分結(jié)構(gòu)域在一些物種的不同成員中有所變化，其中以DELLA結(jié)構(gòu)域的變化最大，在葡萄、蓮、核桃、棉花等物種中為DGLLA，而在谷類作物中DELLA結(jié)構(gòu)域也為DGLLA[12]，表明DELLA蛋白家族在不同物種中功能可能具有一定的多樣性。啟動子作用元件分析表明，3個葡萄DELLA蛋白基因均含有GA和胚乳發(fā)育相關(guān)的調(diào)控元件，表明DELLA蛋白可能參與GA信號傳導(dǎo)調(diào)控葡萄無核果實的發(fā)育。

熒光定量PCR表達(dá)分析結(jié)果表明，除種子區(qū)中特異表達(dá)外，3個DELLA蛋白基因在葡萄不同發(fā)育時期的果皮、果肉及種子區(qū)中均有表達(dá)。且3個基因相比，所有檢測組織中的表達(dá)量明顯較高。類似的，在蘋果、甜櫻桃、黃瓜、大豆、花生、棉花等植物中的研究發(fā)現(xiàn)，DELLA蛋白基因在所有組織中也均有表達(dá)，且在花或果實中的表達(dá)豐度較高[17,28]，但并不是DELLA蛋白基因在各組織中均有表達(dá)，和在擬南芥所有組織中均表達(dá)，但的表達(dá)卻具有組織特異性，僅在種子萌芽、幼苗期、花及長角果中高表達(dá)，但在莖、葉等組織中幾乎不表達(dá)[6]。Hu等[29]對棉花的4個研究發(fā)現(xiàn)，所有檢測組織中的表達(dá)水平顯著高于其他，與本研究結(jié)果相一致。進(jìn)一步比較赤霉素處理與對照樣品的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)赤霉素處理均降低了3個DELLA蛋白基因的表達(dá)量，與楊光等[18]的研究相一致，表明葡萄DELLA蛋白基因被外源GA反饋抑制調(diào)節(jié)，且DELLA蛋白基因可能響應(yīng)GA信號在調(diào)控葡萄無核果實發(fā)育的過程中起著重要作用。

由于缺乏典型的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DELLA蛋白常與其他調(diào)控蛋白結(jié)合互作，通過影響互作蛋白的功能而起作用。研究表明，DELLA蛋白可與GA受體GID1結(jié)合形成GID1-GA-DELLA復(fù)合三聚體，再通過SCF（SKP1-CUL1-F-box）標(biāo)記該三聚體，然后通過誘導(dǎo)泛素26S蛋白酶體降解DELLA蛋白對植物生長的抑制作用[30]。本研究通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)葡萄3個DELLA蛋白均可能與GID1和SLY1互作，在擬南芥、甘藍(lán)、水稻中，DELLA蛋白也可與GID1和SLY1互作，從而負(fù)向調(diào)節(jié)GA信號途徑[13-14,31-32]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，除GIDI和SLYI外，光敏色素互作因子（phytochrome interacting factors，PIFs）蛋白、GRAS蛋白SCL3（SCARECROWLIKE3）、EL1編碼酪蛋白激酶1等還可與DELLA蛋白之間進(jìn)行互作，從而抑制植物的生長[11,33-34]。但DELLA蛋白上下游基因、DELLA蛋白與其他激素間的互作機(jī)制極其復(fù)雜，具體的互作機(jī)制仍需進(jìn)一步驗證研究。

4 結(jié)論

葡萄基因組中含有3個DELLA蛋白基因家族成員，不同物種DELLA蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)化高度保守。在葡萄果實發(fā)育過程中，GA可能通過負(fù)調(diào)控這3個成員參與葡萄果皮、果肉和種子區(qū)的發(fā)育，且3個成員均可能通過應(yīng)答GA信號調(diào)控葡萄無核果實的發(fā)育，其中在葡萄種子區(qū)中是DELLA蛋白基因家族中應(yīng)答GA信號的重要因子。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Genome-Wide Identification and Expression of DELLA Protein Gene Family during the Development of Grape Berry Induced by Exogenous GA

ZHANG WenYing1, WANG Chen1, ZHU XuDong1, MA Chao2, WANG WenRan1, Leng XiangPeng3, ZHENG Ting1, FANG JingGui1

(1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Institute of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240;3College of Horticulture, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, Shandong)

【Objective】The objectives of this study are to identify the DELLA protein family genes from grapevine () genome, to know the profile of DELLA protein family such as gene number, gene structure and tissue expression in grape, and to explore the mechanism of DELLA protein in gibberellic acid (GA) signaling pathway and in seedless fruit development of grapevine.【Method】DELLA protein genes in grape genome were identified by HMMER and NCBI CDD software based on DELLAgenes fromand rice. The full-length cDNAs were obtained by clone techniques fromgrapevine cv. ‘Rosario Bianco’. Cis-elements of their promoters were identified to predict their potential functions. Their chromosomal localization, gene structures, phylogenetic analysis, physicochemical properties, subcellular localizations and protein interactions were analyzed by bioinformatics analysis softwares. Subcellular localization of DELLA proteins were observed by-mediated transient expression in tobacco leaf.The qRT-PCR method was used to detect the temporal and spatial expression of DELLA protein genes in the grape berry pericarp, berry flesh and seed (or seed area) induced by exogenous GA.【Result】A total of 3 DELLA proteingenes were identified from grape genome, their precise sequences were cloned and verified, named(VIT_201s0011g05260),(VIT_214s0006g00640) and(VIT_211s0016g04630), respectively. Their chromosomal localization, open reading frame (ORF), number of amino acid of DELLA genes were Chr1, 1 773 bp, 590; Chr14, 1 710 bp, 569; Chr11, 1 599 bp, 532, respectively. Gene structure analysis result showed that there no intron and only one exon, and gene structures were highly conserved. Phylogenetic analysis showed that VvGAI1 was closely related to VvRGA, and were clustered into one group, with VvSLR1 was another group. The promoters of the 3 genes all contained elements that were responsible for GA and endosperm development, suggesting that they might be involved in response to GA signaling and endosperm development. Subcellular localization result showed that all 3 grape DELLA proteins were located in the nucleus. The results of qRT-PCR showed that the expression of 3 DELLA genes, except forn the grape berry pericarp, berry flesh and seed area, especially in the seed area. Protein interaction analysis showed that all 3 DELLA proteins were the core components of GA signal transduction in grape, which may interact with GIDI1 and SLY1 in GA signal transduction.【Conclusion】DELLA protein gene family in grapevine contains 3 genes. their structures among different species are highly conserved. GA may participate in the development of berry pericarp, berry flesh and seed area through negative regulation of these three members, and all 3 members may regulate the development of grapes seedless fruit by responding to GA.

grape; DELLA; subcellular location; expression; interaction; gibberellic acid (GA)

2018-02-06；

2018-04-11

國家自然科學(xué)基金青年基金（31301759）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20180113）、上海市浦江人才計劃（16PJ1404900）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費自主創(chuàng)新重大專項（自然科學(xué)）（KYTZ201602）

張文穎，E-mail：2016104035@njau.edu.cn。

王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn