張 杰，苗銀萍，婁亞坤，曾小宇，趙林萍

（鄭州中道生物技術(shù)有限公司，河南鄭州450000）

0 引言

口蹄疫是一種高度接觸性傳染病，豬、牛、羊等偶蹄類動物最易感?？谔阋卟《灸壳肮灿?個血清型，分別命名為O、A、C、南非 I（SAT 1）、南非 II（SAT 2）、南非 III（SAT 3）和亞洲 I（Asia l），不同的口蹄疫病毒血清型之間不產(chǎn)生交叉免疫保護。2005—2014年，我國一共向世界動物衛(wèi)生組織（OIE）報道了115次口蹄疫疫情，其中Asia 1型疫情46次，O型疫情38次，A型疫情31次。2009年以后，我國主要流行O型和A型口蹄疫疫情，其中O型口蹄疫病毒變異性強，傳播廣泛，嚴重危害畜牧養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展［1］。

口蹄疫病毒是一種多抗原表位、高度變異的病毒。病毒無囊膜結(jié)構(gòu)，衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白組成。研究表明，O型口蹄疫病毒表面至少有5個中和抗原表位，其中3個表位集中在VP1蛋白，由G-H環(huán)的133-157和C端的200-213氨基酸殘基組成的線性表位是口蹄疫病毒最重要的抗原位點，也是影響抗原變異的關(guān)鍵位點。VP1蛋白可誘導(dǎo)動物產(chǎn)生中和抗體，是口蹄疫的免疫預(yù)防、遺傳演化的重要研究對象［2］。

本研究以O(shè)型口蹄疫病毒VP1蛋白抗體為檢測靶標，以VP1蛋白HRP酶標記VP1血清抗體為原料，建立一種敏感、特異、快速的血清學(xué)ELISA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

酶標板采購自美國康寧公司；HRP標記的VP1特異性兔抗血清采購自洛陽佰奧通實驗材料中心；ELISA常規(guī)試劑均采購自北京鼎國昌盛公司；血清樣品采集自南陽中道生態(tài)養(yǎng)殖場；液相阻斷ELSIA試劑盒采購自蘭州獸醫(yī)研究所；PCR試劑盒采購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司；基因和引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 VP1抗原制備

從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中調(diào)取O型口蹄疫病毒 O／HKN／10／2004衣殼蛋白編碼序列（GenBank：DQ164887.1），合成基因及引物序列，構(gòu)建重組菌株pET-32a-VP1／BL21，進行蛋白誘導(dǎo)表達。

1.2.2 VP1抗原包被濃度確定

用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋VP1蛋白，濃度分別為400 ng／μL、200 ng／μL、100 ng／μL、50 ng／μL、25 ng／μL，12.5 ng／μL，橫向包被酶標板。陰陽性對照血清進行倍比稀釋1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800，縱向加入酶標板，組成方陣進行間接ELISA。每孔加終止液50 μL，測定OD450 nm值。選擇陽性O(shè)D值接近1.0，陽性O(shè)D值／陰性O(shè)D（P／N）值最大時的抗原包被濃度為最佳工作濃度。

1.2.3 陰陽性對照血清制備

篩選O型口蹄疫病毒抗體陰性、核酸雙陰性豬。處死陰性豬分離血清，用PBS將血清作10倍稀釋，并用0.22μm濾膜過濾除菌，作為陰性對照血清。O型口蹄疫病毒滅活苗免疫豬的血清效價達到1∶2056以上時，分離血清，作為陽性對照血清。

1.2.4 直接競爭ELISA最適反應(yīng)條件的確定

用抗原最適工作濃度進行間接ELISA，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋 HRP標記兔抗血清（1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶10000），以 100μL每孔的量加入酶標板。37℃孵育完成后顯色，讀取OD450 nm值。選擇陽性O(shè)D值接近1.0，P／N值最大時的HRP標記兔抗稀釋度作為最適工作濃度。

1.2.5 直接競爭ELISA閾值判定

取100份陽性血請，按1∶32稀釋后進行直接競爭ELISA檢測。規(guī)定以100份血清的平均OD450值加上3倍標準誤差（SD）作為陽性判定閾值，計算抑制率。

抑制率計算公式：

1.2.6 對已知陽性血清樣品的敏感性試驗

使用O型口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒鑒定獲得120份陽性樣品，使用本方法對樣品進行檢測，驗證本方法的陽性檢出率。

1.2.7 對已知陰性血清樣品的特異性試驗

使用O型口蹄疫病毒液相阻斷ELISA試劑盒鑒定獲得120份陰性樣品，使用本方法對樣品進行檢測，驗證本方法的陰性檢出率。

2試驗結(jié)果

2.1 VP1抗原制備

誘導(dǎo)表達5 h后，提取蛋白并進行SDS-PAGE鑒定，蛋白大小約為32KD（見圖1）。

圖1 重組菌誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果

2.2 包被抗原最適工作濃度

結(jié)果表明，抗原濃度為50 ng／μL時，陽性O(shè)D值接近1.0，P／N值最大，包被抗原的最適工作濃度為50 ng／μL。

2.3 酶標抗體最適濃度

結(jié)果表明，酶標記VP1兔抗血清稀釋度為1∶2000時，陽性O(shè)D值接近1.0，P／N值最大。

確定HRP標記兔抗血清的最佳工作濃度為1∶2000稀釋。

2.4 閾值判定標準

閾值判定標準為：若陽性對照平均OD值＜0.4，陰性對照平均OD值＞0.7，則實驗判定為有效，繼續(xù)計算抑制率。抑制率大于30%為陽性，抑制率小于30%為陰性。

2.5 敏感性試驗

使用本方法檢測120已知陽性臨床血清，檢出陽性樣品109份，有11份未檢出。結(jié)果表明本方法對120份陽性樣品的敏感性為90.8%。

2.6 特異性試驗

使用本方法檢測120已知陰性臨床血清，檢出陰性樣品112份，有8份未檢出。結(jié)果表明本方法對120份陰性樣品的特異性為93.3%。

3 討論

我國目前采取免疫與撲殺相結(jié)合的口蹄疫防控策略，血清學(xué)抗體監(jiān)測是影響疫情防控的關(guān)鍵所在?？谔阋叩难鍖W(xué)診斷廣泛應(yīng)用于進出口貿(mào)易監(jiān)測、疑似病例確診、疫病凈化以及疫苗免疫效果監(jiān)測［3］。其中OIE推薦的血清學(xué)診斷技術(shù)有3種，包括病毒中和試驗（VN）、固相阻斷 ELISA和液相阻斷ELISA。VN試驗是最經(jīng)典的血清學(xué)診斷方法，但是該方法需要使用細胞進行病毒培養(yǎng)，試驗周期長。與VN試驗相比，液相阻斷ELISA和固相阻斷ELISA均縮短了試驗時間，但是仍然需要多次的抗體孵育和洗滌，檢測速度受限制。

本研究建立了一種直接競爭ELISA抗體檢測方法，該方法以O(shè)型口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1作為包被抗原，可針對VP1特異性抗體進行檢測。檢測原理是辣根過氧化物酶（HRP）標記的VP1抗原特異性兔源抗體與待測血清樣品中的口蹄疫病毒抗體競爭結(jié)合酶標板微孔中包被的O型口蹄疫病毒基因工程抗原，然后加入顯色液，通過HRP催化顯色反應(yīng)，顯色深淺與待測樣品中的抗體含量呈反相關(guān)。本方法將血清孵育與酶標抗體孵育同時進行，檢測時間縮短，具備敏感、特異、快速、制備簡單等特點，可廣泛應(yīng)用于O型口蹄疫疫苗免疫效果監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查。