甘露 鄧之婧 王獻(xiàn)哲 蘇棋 梁聰 郭哲 何萍

[摘要]目的 探討二氫楊梅素（DMY）對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注（I/R）損傷的抗細(xì)胞凋亡作用和相關(guān)機(jī)制，從而研究DMY抗腦缺血損傷的保護(hù)機(jī)制。方法 將雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、I/R模型組及DMY（500 mg/kg）組。小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞/再灌注（MCAO/R）局灶性腦I/R損傷模型利用改良線栓法來(lái)進(jìn)行制備與完善。DMY組術(shù)前連續(xù)灌胃給藥10 d，每天1次，并在缺血前1 h及再灌注后12 h各給藥1次。缺血3 h再灌注24 h后，取腦采用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）進(jìn)行凋亡檢測(cè)，免疫組織化學(xué)法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（RT-qPCR）分別檢測(cè)凋亡相關(guān)因子Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）蛋白及mRNA 表達(dá)。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，在I/R模型組中，小鼠缺血腦組織中凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增高，凋亡相關(guān)因子Bcl-2蛋白及基因表達(dá)下降（P<0.01），而B(niǎo)ax的蛋白及基因表達(dá)增強(qiáng)（均P<0.01）。與I/R模型組比較，DMY組小鼠缺血腦組織凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率顯著下降，Bcl-2蛋白及基因表達(dá)增強(qiáng)，Bax蛋白和基因表達(dá)下降（均P<0.01）。結(jié)論 DMY可減輕小鼠局灶性腦I/R損傷所致的細(xì)胞凋亡，其抗凋亡機(jī)制可能與DMY上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]二氫楊梅素；腦缺血/再灌注損傷；大腦中動(dòng)脈阻塞；細(xì)胞凋亡

[中圖分類號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）5（b）-0004-05

Study on anti-apoptosis effect and mechanism of dihydromyrcetin on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in mice

GAN Lu1 DENG Zhi-jing1 WANG Xian-zhe1 SHU Qi1 LIANG Cong1 GUO Zhe HE Ping

1.Pharmaceutical College of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China；2.Department of Emergency，the Third Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530031，China；3.Laboratory Animal Center，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China

[Abstracts]Objective To study the anti-apoptosis effect of dihydromyricetin （DMY） on acute focal cerebral ischemia/reperfusion （I/R） injury in mice.Methods Male Kunming mice were randomly divided into sham group，I/R group and DMY group （500 mg/kg）.Mice model of I/R injury was established by middle cerebral artery occlusion （MCAO） using modified thread method.Daily intragastric administration of DMY was carried out 10 days before the surgery，and 1 hour before ischemia and 12 hours after reperfusion.The brain tissues of the mice were harvested after ischemia for 3 hours and reperfusion for 24 hours.Myocyte apoptosis in the cerebral I/R brain was detected with in situ terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL staining） .The protein and mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by immunohistochemistry assay and real-time quantitative PCR （RT-qPCR） respectively.Results Compared with sham group，apaotosis index was significantly higher，protein and mRNA expressions of Bcl-2 were lower than those of Bax were higher in I/R model group （all P<0.01）.Compared with I/R model group，in DMY group，apoptosis index decreased significantly，the expressions of Bcl-2 were higher，those of Bax were lower （all P<0.01）.Conclusion DMY can reduce the myocyte apoptosis induced by focal I/R injury，its anti-apoptotic mechanism might be related to regulating the expressionof Bax and Bcl-2.

[Key words]Dihydromyricetin；Cerebral ischemia/reperfusion injury；Middle cerebral artery occlusion；Apoptosis

腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion injury，I/R）損傷涉及多種病理機(jī)制，越來(lái)越多的論據(jù)表明，細(xì)胞凋亡（apoptosis）在腦I/R損傷中發(fā)揮重要的作用。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種具有多種藥用價(jià)值的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DMY對(duì)于小鼠急性局灶性腦 I/R損傷，可以起到抗氧化、抗炎的保護(hù)作用[2-3]。本研究采用改良線栓法制備小鼠腦I/R損傷模型，觀察DMY對(duì)腦I/R損傷后細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2蛋白和基因表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究DMY對(duì)急性腦I/R損傷的抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體重為25～30 g的SPF級(jí)雄性昆明種小鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并有合格證號(hào)：SCXK桂2014-0002。

1.2 主要藥品與試劑

DMY（購(gòu)于西安開(kāi)來(lái)生物工程有限公司，純度98.33%，批號(hào)K130311），臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉配成50 mg/ml混懸液。異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司，批號(hào)217151201）。原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒（Roche，瑞士）。兔抗鼠Bax和Bcl-2一抗（北京博奧森）；SP免疫組化檢測(cè)試劑盒（北京中杉）；β-actin、Bax和Bcl-2引物（Takara）；RNAiso Plus Total RNA 提取試劑盒，PrimeScript TMRT reagent kit with gDNA Eraser（perfect real time）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBRRPremix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）試劑盒（Takara）。

1.3主要儀器設(shè)備

R580動(dòng)物麻醉機(jī)（瑞沃德生命科技有限公司）；XTZ-D體式顯微鏡（上海光學(xué)五廠）；DMR+Q550病理圖像分析儀（德國(guó)Leica）；7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.4動(dòng)物分組和給藥方法

42只昆明小鼠隨機(jī)分成3組，即動(dòng)物假手術(shù)組、I/R動(dòng)物模型組和DMY（500 mg/kg）組，每組14只。DMY組在造模前，每天1次，連續(xù)10 d相同時(shí)間段，灌胃給予DMY 500 mg/kg，而后在缺血前1 h給藥1次，再灌注后12 h再灌胃1次；動(dòng)物假手術(shù)組和I/R動(dòng)物模型組相同時(shí)間段灌胃等同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.5小鼠局灶性腦I/R損傷模型制備

局灶性腦I/R模型通過(guò)改良線栓法建立和完善[4]。準(zhǔn)備好解剖顯微鏡和器械，麻醉后鏡下小心剪開(kāi)頜骨下皮膚并利用微型剪慢慢剝離，在靠近氣管旁找到左頸總動(dòng)脈，完全剝離出至少3 cm的長(zhǎng)度，而后先在動(dòng)脈下先穿過(guò)3根結(jié)扎線，最下邊的線結(jié)扎靠近近心端的動(dòng)脈段，最上邊的線放在最遠(yuǎn)離心臟的動(dòng)脈端，利用微型剪在動(dòng)脈中間位置剪開(kāi)約1/2大小的口子，開(kāi)始插入帶有硅膠潤(rùn)滑頭部的線栓（直徑為0.20～0.23 mm）約0.6 cm后，稍改變方向后再插入0.2～0.3 cm后用預(yù)先放好的結(jié)扎線固定。在缺血3 h后，利用同法撥出線栓后結(jié)扎頸總動(dòng)脈，經(jīng)過(guò)24 h缺血再灌注后行多聚甲醛灌注取腦。假手術(shù)組鏡下小心分離并結(jié)扎左頸總動(dòng)脈，不需要插線栓。

1.6 TUNEL法測(cè)凋亡

腦細(xì)胞凋亡再灌注24 h后，每組取6只小鼠，用4%多聚甲醛灌注心臟至全身后取腦，繼續(xù)放于多聚甲醛中固定24 h以上。取缺血區(qū)腦組織約3 mm大小進(jìn)行酒精梯度濃度脫水，用石蠟法包埋好組織，以切片機(jī)切出每張厚度為4 μm的薄切片。進(jìn)行蘇木精-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織缺血灶的病理性變化；根據(jù)TUNEL試劑盒步驟和方法進(jìn)行腦組織的細(xì)胞凋亡染色。每只小鼠隨機(jī)挑選缺血腦組織的周邊區(qū)4個(gè)互不重疊的400倍高倍視野，分別對(duì)細(xì)胞核總數(shù)和凋亡細(xì)胞核數(shù)計(jì)算，并計(jì)算凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率（%）。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率（%）=（凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)）×100%。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)由病理圖像分析儀分析計(jì)算。

1.7免疫組織化學(xué)法測(cè)定蛋白表達(dá)

按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行腦Bax和Bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)染色。每只小鼠缺血腦組織周邊區(qū)隨機(jī)選4個(gè)互不重疊、互不干擾的400高倍視野，并由軟件分析Bax和Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞百分比（%）。

1.8 RT-qPCR測(cè)定腦Bax和Bcl-2 mRNA的基因表達(dá)

再灌注24 h后，每組另取8只小鼠，取小鼠缺血側(cè)腦組織進(jìn)行勻漿，按照試劑盒說(shuō)明抽提總RNA后，由核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA濃度和純度。對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得產(chǎn)物cDNA，之后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃ 變性30 s，35℃ 退火35 s，72℃ 延伸1 min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，設(shè)內(nèi)參β-actin進(jìn)行標(biāo)化。結(jié)果分析以2-ΔΔCt法計(jì)算相應(yīng)的mRNA表達(dá)水平，即以目的基因的Ct值與β-actin的Ct值的差值ΔCt，計(jì)算2-ΔΔCt =2-（ΔCt 實(shí)驗(yàn)組-ΔCt 對(duì)照組），作為相對(duì)含量進(jìn)行分析?；蛞镄蛄斜硪?jiàn)表1。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析及LSD 檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 DMY對(duì)小鼠腦組織缺血周邊區(qū)細(xì)胞凋亡的影響

鏡下觀察，TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞的胞核呈現(xiàn)出棕褐色。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞率測(cè)定結(jié)果表明，假手術(shù)組幾乎無(wú)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)[（8.67±2.08）%]。與假手術(shù)組比較，I/R模型組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[（80.33±5.50）%]明顯增加（P<0.01）；而DMY組中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[（31.00±3.61）%]較I/R模型組顯著減少（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。

Bcl-2陽(yáng)性染色主要位于胞質(zhì)。假手術(shù)組可見(jiàn)大量陽(yáng)性面積表達(dá)[（71.00±6.04）%]，與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[（30.40±3.51）%]減少（P<0.01）；與而與I/R模型組比較，DMY能明顯增加Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量[（46.60±2.07）%]（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。

2.3 DMY對(duì)小鼠缺血腦組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響

進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算后可得，與假手術(shù)組[（0.97±0.03）倍]比較，I/R模型組的Bax mRNA表達(dá)量[（10.81±1.62）倍]明顯上調(diào)（P<0.01）；與I/R模型組比較，DMY組顯著下調(diào)Bax mRNA表達(dá)量[（5.65±0.37）倍]（P<0.01）。在I/R模型組中Bcl-2 mRNA表達(dá)量[（0.10±0.01）倍]較假手術(shù)組[（1.02±0.03）倍]明顯降低（P<0.01）；與I/R模型組比較，DMY組Bcl-2 mRNA表達(dá)量[（0.29±0.51）倍]顯著增加（P<0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖7。

3討論

本研究在建立小鼠大腦I/R損傷模型的基礎(chǔ)上觀察DMY對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注后抗細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制。腦缺血再灌注損傷之后可引起以細(xì)胞凋亡為主要機(jī)制的炎癥損傷[5]。腦缺血后，細(xì)胞在形態(tài)上表現(xiàn)皺縮，細(xì)胞間隙加大并脫離，密度增加引起通透性改變，核質(zhì)濃縮，核膜核仁發(fā)生破裂。腦缺血再灌注后，主要通過(guò)缺血細(xì)胞中的鈣離子沉積、氧化應(yīng)激、線粒體因素來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)[6]。通過(guò)TUNEL染色后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)出現(xiàn)明顯細(xì)胞固縮變形，體積變小，核染色質(zhì)呈現(xiàn)邊集化，與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致[7]。腦I/R損傷后，缺血區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，而DMY可以減少缺血區(qū)細(xì)胞凋亡的數(shù)量。研究結(jié)果提示DMY可通過(guò)抗凋亡作用保護(hù)腦I/R損傷。

炎癥反應(yīng)直接參與損傷細(xì)胞的同時(shí)又可通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑[8]、細(xì)胞表面的死亡受體如Fas和腫瘤壞死因TNF-R引發(fā)的外源性途徑[9-10]等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡間接導(dǎo)致?lián)p傷。在腦血管疾病中，細(xì)胞中線粒體功能急性紊亂是首先發(fā)生的，也是基本的因素[11]。腦缺血再灌注損傷主要涉及線粒體功能的障礙和衰竭，包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裂解和超微結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致細(xì)胞主要通過(guò)內(nèi)源性途徑發(fā)揮凋亡作用，所以內(nèi)途徑通路在缺血再灌注損傷中表現(xiàn)得尤為重要。內(nèi)途徑主要是由Bax和Bcl-2這兩個(gè)相互為拮抗的蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來(lái)激活胱冬肽酶-3（caspase-3），從而發(fā)揮作用[12]。作為體內(nèi)重要的凋亡調(diào)節(jié)因子，存活基因Bcl-2的主要作用是抑制細(xì)胞凋亡，促凋亡基因Bax則通過(guò)作用于線粒體釋放其中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1，使之與Cytc共同激活caspase信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Bax和Bcl-2的比例失衡，使促凋亡因子細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)中，從而和caspase-9形成復(fù)合物后，作為細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑的發(fā)起者，進(jìn)一步激活下游caspase-3，并且啟動(dòng)凋亡的過(guò)程誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。針刺對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的抗細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制是Bcl-2表達(dá)上調(diào)和Bax和caspase表達(dá)下降[14]；三七總皂苷R1激活Bcl-2的表達(dá)以及通過(guò)抑制Bax蛋白表達(dá)的來(lái)減少腦梗死面積，減少細(xì)胞凋亡[15]；DMY逆轉(zhuǎn)由3-硝基丙酸誘導(dǎo)的大鼠行為缺陷和紋狀體組織病理?yè)p傷，通過(guò)誘導(dǎo)Bcl-2的上調(diào)，使細(xì)胞凋亡明顯減少[16]。Bcl-2是抑制凋亡因子，所以說(shuō)Bax和Bcl-2的表達(dá)影響著細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而這不僅僅是體現(xiàn)在腦血管疾病中，在抗腫瘤中的作用也是如此。左彥珍等[17]發(fā)現(xiàn)，DMY可以通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax的比值來(lái)促進(jìn)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡而起到抗腫瘤作用；DMY還可以通過(guò)保護(hù)氧化應(yīng)激，下調(diào)半胱氨酸蛋白酶活化和上調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡[18]。綜上所述，細(xì)胞凋亡主要依賴內(nèi)源性途徑，Bax和Bcl-2作為介導(dǎo)內(nèi)源性途徑的凋亡相關(guān)因子扮演著重要角色。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化法測(cè)定Bcl-2和Bax的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，并進(jìn)一步用熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)mRNA表達(dá)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，腦I/R損傷后，I/R模型組Bax蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)，而B(niǎo)cl-2蛋白和mRNA表達(dá)均顯著下降，Bax>Bcl-2，說(shuō)明腦I/R損傷后腦神經(jīng)細(xì)胞抗凋亡能力下降，表現(xiàn)為促進(jìn)凋亡。而在DMY組，DMY明顯抑制Bax上調(diào)，上調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)。由此可知，預(yù)先給予DMY能減少腦I/R損傷細(xì)胞內(nèi)損傷后細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2病理性調(diào)控所引發(fā)的凋亡。提示細(xì)胞凋亡的早期，線粒體在核染色體DNA還未改變之前就已經(jīng)出現(xiàn)改變，說(shuō)明其凋亡過(guò)程可能有線粒體來(lái)完成[19]。以上結(jié)果提示DMY可以通過(guò)抑制I/R損傷后的細(xì)胞凋亡反應(yīng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，機(jī)制可能語(yǔ)Bax/Bcl-2介導(dǎo)的凋亡途徑有關(guān)[20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DMY可以減輕神經(jīng)元凋亡，同時(shí)下調(diào)Bax蛋白及mRNA表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)，提示DMY對(duì)腦I/R損傷的神經(jīng)保護(hù)作用可能歸因于對(duì)抗細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡途徑有關(guān)。

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（收稿日期：2018-03-19 本文編輯：許俊琴）