張 鳳， 朱 艷， 許 娜， 宋裕丞， 秦民堅

(中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院 中藥資源系 天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室， 江蘇 南京 210009)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)根莖具有益精強陰、生津止渴和補虛羸等功效[1]，被批準(zhǔn)實施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護[2]。為解決霍山石斛種子在自然條件下萌發(fā)困難和繁殖周期長等難題，已成功建立其離體快繁體系并工廠化生產(chǎn)[3]，并對其植株營養(yǎng)器官的解剖結(jié)構(gòu)[4]及采用莖段誘導(dǎo)類原球莖的發(fā)育過程[5]進行了研究。為進一步明確霍山石斛種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的原理，作者采用植物組織培養(yǎng)和石蠟切片技術(shù)，對霍山石斛種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育過程中細胞和組織結(jié)構(gòu)的變化進行了解剖觀察，以期為霍山石斛的組培繁育機制和細胞組織學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試霍山石斛成熟未開裂的蒴果采自安徽省霍山縣太平畈鄉(xiāng)王家店村，經(jīng)中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院秦民堅教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于中國藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源系。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)和取樣 將蒴果用洗衣粉水(5 g洗衣粉加入300 mL水)浸泡15 min，流水沖洗30 min；置于無菌條件下，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡振蕩45 s，無菌水潤洗2次；再用體積分?jǐn)?shù)30%NaClO溶液浸泡振蕩15 min，無菌水潤洗5次；吸干蒴果表面水分，橫向切開，將種子接種于萌發(fā)培養(yǎng)基(1/2MS，含0.2 mg·L-1NAA、30.0 g·L-1蔗糖和5.6 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)；于溫度(23±2) ℃、光照時間11 h·d-1、光照度1 500～2 000 lx條件下培養(yǎng)。每5 d取樣1次，各取樣8～10份；不同取樣期種子均用FAA固定，備用。

1.2.2 原球莖發(fā)育和取樣 待種子長至0.5～1.0 cm的原球莖后，轉(zhuǎn)入增殖壯苗培養(yǎng)基(1/2MS，含0.2 mg·L-1NAA、1.0 mg·L-16-BA、1.0 g·L-1活性炭、30.0 g·L-1蔗糖和5.6 g·L-1瓊脂粉，pH 6.0)；5～8個為1簇，每瓶接種6～8簇；于溫度(23±2) ℃、光照時間12 h·d-1、光照度2 000～2 500 lx條件下培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)10、30和45 d以及約50 d的具葉片和不定根的幼苗，各取樣8～10份；去除葉片，沿莖基部切成7 mm小段，不定根切成5 mm小段，用FAA固定，備用。

1.2.3 制片和觀察 采用石蠟切片法[6]制片，縱切，每個樣本至少40個載玻片。采用1X71光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)觀察，選擇結(jié)構(gòu)清晰、染色效果較好的視野拍照。

2 結(jié)果和分析

2.1 種子萌發(fā)過程中細胞和組織結(jié)構(gòu)的變化

結(jié)果(圖1)顯示：霍山石斛種子具種皮和種胚，無胚乳。種皮由1層透明的薄壁細胞組成，無內(nèi)含物；種胚呈橢圓形，表面為1層體積小且排列緊密的細胞，內(nèi)含物較多(圖1-A)。培養(yǎng)5 d后，種胚體積明顯增大，內(nèi)含物被消耗，細胞結(jié)構(gòu)逐漸清晰，一端突破種皮(圖1-B)；繼續(xù)培養(yǎng)，種胚一端出現(xiàn)極性，細胞增大，分裂緩慢；另一端分化出較多體積小、細胞質(zhì)濃的細胞，體現(xiàn)分生細胞的特點；這些細胞不斷增殖分化逐漸向外凸起，向種皮合點端靠近，并隨種胚體積進一步擴大。培養(yǎng)8～10 d后，種胚突破種皮形成原球莖(圖1-C)；種胚發(fā)育成圓球體(即球形胚)；合點端細胞發(fā)育形成體積小、細胞質(zhì)濃的頂端分生組織細胞，而另一端細胞體積較大。培養(yǎng)約15 d后，原球莖頂端的原分生組織進一步分化出葉原基，葉原基細胞排列致密、細胞質(zhì)濃，外層細胞小且排列規(guī)則，中間細胞體積較大；球形胚發(fā)育形成心形胚(圖1-D)。培養(yǎng)20 d后，葉原基發(fā)育為子葉，細胞不斷分化，體積變大，形成幼葉；心形胚發(fā)育形成魚雷形胚(圖1-E)。培養(yǎng)30 d后，葉原基基部細胞分裂旺盛，向外繼續(xù)分裂，向內(nèi)分化出1束明顯的維管束；表皮始終為1層體積小且排列緊密、細胞核大的細胞，中間及基部的薄壁細胞體積較大；維管束周圍圍繞著分生組織細胞(圖1-F)，使維管束不斷向基部延伸，最終連接根和葉。

Sc： 種皮Seed coat； Am： 頂端分生組織Apical meristem； Co： 子葉Cotyledon； Vb： 維管束Vascular bundle； Lp： 葉原基Leaf primordium； L1，L2： 原套層Tunica layer； L3： 原體層Corpus layer； Vb-Rh： 根狀莖維管束Vascular bundle in rhizome； Vb-R： 根維管束Vascular bundle in root； Ar： 不定根Adventitious root； Bp： 芽點Bud point.A-F： 分別為萌發(fā)0、5、10、15、20和30 d的種子縱切面Longitudinal section of seed at 0， 5， 10， 15， 20， and 30 d of germination， respectively； G： 原球莖頂端分生組織Apical meristem of protocorm； H： 原套-原體結(jié)構(gòu)Tunica-corpus structure； I： 具2枚葉的原球莖Protocorm with 2 leaves； J： 具3～5枚葉的原球莖Protocorm with 3-5 leaves； K： 根狀莖的多束維管束Many vascular bundles in rhizome； L： 根狀莖和根的維管束Vascular bundles in rhizome and root； M： 具不定根的植株P(guān)lant with adventitious roots.圖1 霍山石斛種子萌發(fā)及原球莖發(fā)育過程中縱切面解剖結(jié)構(gòu)變化Fig. 1 Changes in anatomical structures of longitudinal section during processes of seed germination and protocorm development of Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng

2.2 原球莖發(fā)育過程中細胞和組織結(jié)構(gòu)的變化

結(jié)果(圖1)顯示：霍山石斛原球莖頂端分生組織的縱剖面(圖1-G)由外到內(nèi)明顯分為3層，即原套L1層、原套L2層和原體L3層(圖1-H)。原套L1層的細胞規(guī)則且排列緊密、細胞體積大、細胞核大，形成表皮層；原套L2層的細胞排列有序，細胞形態(tài)與原套L1層和原體L3層細胞有差異，且細胞大小介于兩者之間；原體L3層由數(shù)層細胞組成，細胞排列不規(guī)則、體積小、細胞質(zhì)濃、細胞核較原套L1層??；整體上看，原套L1層和原套L2層與原體L3層的細胞垂直呈環(huán)狀“T”形。

隨原球莖頂端分生組織細胞在各方向不斷生長分裂，在原體細胞下部形成新的葉原基；當(dāng)原體L3層的數(shù)層細胞體積不斷增大進入原套L1層時，葉原基即分化成子葉。繼續(xù)培養(yǎng)，原球莖頂端子葉繼續(xù)生長分化形成幼葉，同時，頂端分生區(qū)細胞向內(nèi)分化形成維管束(圖1-I)；維管束周圍包裹著排列緊密、體積小、細胞質(zhì)濃、細胞核大的分裂細胞，構(gòu)成原形成層。在幼葉不斷增大的過程中，靠近基部的細胞體積變大轉(zhuǎn)化為居間分生組織，原形成層細胞的代謝能力逐漸增大，細胞分裂旺盛，同時不斷分化形成薄壁細胞(圖1-J)；維管束細胞分裂增多并向基部延伸，形成多束維管束，此時，由原球莖階段進入根狀莖階段(圖1-K)；此階段，莖頂端分生區(qū)由體積小、細胞核大、細胞質(zhì)濃且排列緊密的基本分生組織細胞組成，這些細胞不斷分裂使根狀莖伸長增粗。將無菌苗轉(zhuǎn)入增殖壯苗培養(yǎng)基后，根狀莖基部逐漸膨大，根狀莖內(nèi)維管束向基部延伸形成根維管束；根維管束周圍近基部細胞的細胞質(zhì)濃、細胞核較大、液泡縮小，逐漸分化形成根原基細胞，并隨根原基的不斷分化和伸長，形成不定根(圖1-L)。在生長過程中，霍山石斛根狀莖基部及節(jié)間不斷萌發(fā)出芽點，其表皮或皮層細胞不斷分裂形成細胞質(zhì)濃、分裂能力較強的側(cè)生分生區(qū)，可直接分化成芽或繼續(xù)延伸生長成為根狀莖的分支， 形成叢生根狀莖后再繼續(xù)分化出芽(圖1-M)。

3 討 論

霍山石斛種子發(fā)育成苗經(jīng)過種胚、原球莖、根狀莖和完整植株4個階段，其發(fā)育過程大致遵循蘭科(Orchidaceae)植物種子發(fā)育的基本規(guī)律。大部分蘭科植物種子成熟時種胚仍處于原胚階段，存在分化不完全現(xiàn)象，在自然條件下極難萌發(fā)[7]。而霍山石斛種子在蘭科植物中較為特殊，種胚具退化子葉[7]、胚細胞中含有供其自身生長的營養(yǎng)物質(zhì)，加之特殊的種皮結(jié)構(gòu)，借助組織培養(yǎng)技術(shù)使其易于萌發(fā)。觀察結(jié)果顯示：霍山石斛種子萌發(fā)時不形成胚根，而是種胚和種皮先吸水膨脹，待種胚體積膨大突破種皮發(fā)育成原球莖，其遠離種胚極性的一端密生白色絨毛狀假根，可吸收培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)供原球莖的生長發(fā)育，此萌發(fā)過程與石斛屬(DendrobiumSw.)種類[8]和獨蒜蘭〔Pleionebulbocodioides(Franch.) Rolfe〕[9]等相似。通過原球莖增殖培養(yǎng)可迅速獲得大量生長能力較強的試管苗，此過程也是霍山石斛離體快繁的關(guān)鍵。

霍山石斛組織培養(yǎng)形成的根狀莖有別于自然條件下產(chǎn)生的根狀莖，自然條件下其根狀莖增殖緩慢、出芽少，而組培條件下其根狀莖的節(jié)間或基部均可分化出芽或增殖形成叢生根狀莖，且分支多、增殖快。節(jié)間處分化的芽能夠迅速分化出不定根，與母株分離后即為新植株；而叢生根狀莖也可伸長生長，通過分株繁殖新植株；營養(yǎng)莖端在生長過程中不斷分化出新的葉原基并發(fā)育成新葉，可以通過控制生長條件調(diào)控側(cè)生器官葉和芽的生長發(fā)育?；羯绞蚯o的這些繁殖特性均有利于其離體快繁。

霍山石斛原球莖性狀較穩(wěn)定，在其發(fā)育過程中頂端分生組織細胞的分裂方式和伸長方向各異，不同位置的細胞增殖速率也不同，形態(tài)差異明顯，通過“原套-原體學(xué)說”[10]能較合理地解釋霍山石斛原球莖頂端分生組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化過程?；羯绞蚯o中原套部分的細胞通常不止1層，可分為原套L1層和L2層，但在不同生長發(fā)育時期原套L2層細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異，故原套細胞層數(shù)及區(qū)分原體的臨界點僅通過石蠟切片很難準(zhǔn)確界定。此外，在霍山石斛原球莖頂端分生區(qū)劃分、細胞分裂和增殖的分子機制等方面缺乏深入了解，有待利用多學(xué)科手段進行深入研究。