劉芳怡　賈文倩

摘 要：目的：核干細胞因子表達對HL-60細胞的影響；方法： 采用逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）方法檢測NS基因及蛋白在HL-60白血病細胞中的表達。結(jié)果：RT-PCR檢測結(jié)果顯示 NS在白血病細胞系HL-60中呈表達狀態(tài)。結(jié)論： NS在白血病細胞系HL-60中表達。

關(guān)鍵詞：核干細胞因子 HL-60細胞 影響

中圖分類號：R-01 文獻標識碼：A 文章編號：1003-9082（2018）07-0-02

白血病是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病率越來越高，死亡率也很高，這就嚴重影響了國民健康。但是隨著聯(lián)合化療的不斷發(fā)展，骨髓移植術(shù)的不斷提高，免疫治療及基因治療的不斷改善，急性白血病的治療效果明顯得到了很大的提高。有研究報道核干細胞因子在正常造血系統(tǒng)的造血干細胞中發(fā)現(xiàn)，在成熟細胞和淋巴細胞沒有發(fā)現(xiàn)它的蹤跡；白血病細胞是些不分化的幼稚細胞，無限增殖克隆，因此，NS在白血病細胞可發(fā)現(xiàn)，但目相關(guān)關(guān)NS在白血病細胞表達的研究不多甚至少有。能不能通過抑制NS蛋白在白血病細胞中表達從而阻止細胞的增殖方式尚有待進一步研究，TPT對白血病細胞的抗腫瘤作用與NS基因的表達之間是否存在相關(guān)的關(guān)系有待進一步探索。

一、材料與方法

1.材料

1.1細胞株

人源性白血病細胞系HL-60細胞，由中國協(xié)和醫(yī)科大學腫瘤研究所提供。

2.方法

2.1細胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度下的恒溫箱中進行常規(guī)培養(yǎng)，平均2-3天換液一次，正常情況下細胞生長懸浮成團，大小較均一，光滑圓潤，細胞膜完整，生長狀態(tài)良好，取2X106的細胞進行實驗。

2.2提取RNA

2.2.1參照TRIZOL提取試劑盒說明書，依次進行下列步驟。

（1）首先把待檢細胞收集一起，然后在離心機上離心各組細胞。然后用PBS洗滌兩次，將洗后的細胞移入1.5mlEP管中，該EP管不含RNase，離心轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)每分，離心5min，棄去上清液。

（2）在每個EP管中加入提取試劑盒中的 TRIZOL試劑，并混勻，在低溫離心機中離心。

（3）在4℃離心機中取出離心好的EP管，放置室溫，5min，使混合物物充分溶解。然后在每管中加入氯仿試劑200μl，包埋EP管中內(nèi)樣品，將EP管在振蕩機上高速振蕩，混勻，放置室溫5分鐘，然后放置在4℃低溫離心機中置離心，12000rpm ，15min，此時，EP管中液體開始分為兩層：上層無色，成為水相；下層粉紅色，稱為苯酚氯仿相。

（4）轉(zhuǎn)移上層無色水相，于潔凈的無RNase的1.5mlEP管中，然后再加入0.5ml異丙基醇，慢慢混勻，放置室溫靜放10min，可見到白色絮狀沉淀物形成，放置在4℃離心機中離心，離心速度為12000rpm，離心時間為10min。

（5）離心后，可見沉積在管壁或管底的絮狀物，即為RNA沉淀，棄去EP管中的上清液體，加入1ml濃度為 75%的乙醇，乙醇內(nèi)應不含RNase，隨即旋轉(zhuǎn)充分上下?lián)u勻，然后再放置4℃離心機中離心5min，轉(zhuǎn)速為7500rpm。

（6）再次溶解：離心后，取出EP管，輕輕棄去上層離心清液，然后將此EP管置于無菌操作臺內(nèi)，待其自然涼干，風干。每管加入不含RNase的處理后的三蒸水水，放于55℃水浴鍋內(nèi)10min，等待RNA完全溶解其中后，分裝，保存在-70℃冰箱備用。

以上所使用儀器均已過DEPC水浸泡處理，以上所有步驟均需謹慎避免被RNase污染。

2.2.2 RNA的完整性及含量測定

測定RNA完整性：取5?l上述步驟提取的RNA樣品，在15g/L瓊脂糖凝膠中電泳，瓊脂糖中含6%甲醛，電壓8V/cm，30分鐘后，取出凝膠，在凝膠掃描成像系統(tǒng)下觀測電泳結(jié)果并拍照。

測定其中RNA含量：單鏈RNA定量采用分光光度法，取5?l RNA樣品，稀釋至100?l后加在比色杯中，放置于紫外分光光度儀內(nèi)檢測260nm波長下吸光光度值和280nm波長下吸光光度值，進行下列計算：（1） 單鏈RNA的純度：純的單鏈RNA OD280/OD260比值在溶液中的正常參考范圍為1.8～2.0。若此OD比值低于了1.6，則說明樣品不純，樣品極大程度可能被蛋白質(zhì)或酚等雜質(zhì)所污染，應丟棄不用，再進一步重復上述步驟抽提RNA。（2） 單鏈RNA的濃度的計算：在分光光度儀上波長為260nm下，1OD260=40?g/ml的單鏈RNA。此時我們可按下述公式計算單鏈RNA含量：單鏈RNA含量（?g/?l）=OD260（波長為260nm時的光度值）×所稀釋的倍數(shù)×40?g/1000?l。

2.2.3 cDNA的制備

cDNA的制備通過購買試劑盒并參照試劑盒說明書進行下列步驟：

（1）在取好的碎冰上放置若干無RNase 0.5mlEP管，然后在各管中加入由上述步驟提取好的5?lRNA，并加入隨機引物1?l和ddH2O 6?l。

（2）用手輕輕上下左右搖動混勻上述物質(zhì)，在離心機上以12000r/min離心5s，取出放在70℃水浴鍋中水浴5分鐘，然后取出快速放于備好的碎冰上冷卻，再在離心機上以12000r/min離心5s。

（3）低溫下放于碎冰時向各EP管依次加入：5×buffer 4?l、RNasin 1?l 、10mM dNTP 2?l，加好后混勻，再于離心機上以12，000r/min離心5s，然后放置室溫（25℃）下，或在水浴鍋中溫育5min。

（4）RevertAidTM M-MuLV reverse transcriptase（200U/?l） 1?l，加到各EP管中，總體積20?l。

（5）12000rpm離心5s，25℃水浴中放置10min，然后放置調(diào)好溫度為42℃的水浴中育60min。

（6）再放置在溫度為70℃的水浴鍋中水浴10min，此時反應終止，取出放置在碎冰上冷卻，備下列中步驟所用或-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 PCR反應

（1）取0.2ml新擴增管，要滅菌處理，本實驗所選取的PCR擴增體系是25?l的擴增體系，此擴增體系中共包含下列試劑：

將加進去的物質(zhì)混勻，離心機內(nèi)以12000rpm離心5s，然后放進DNA熱循環(huán)擴增儀進行PCR擴增，經(jīng)過設定好的程序后等待擴增結(jié)果。

（2）NS擴增程序和步驟：95℃進行預變性5min，94℃進行變性30s，56℃發(fā)生退火30s，72℃進行延伸50s，經(jīng)歷31個循環(huán)，再在72℃延伸5min。

二、結(jié)果

RT-PCR檢測結(jié)果顯示 NS在白血病細胞系HL-60。

根據(jù)RT-PCR的電泳結(jié)果可見：NS擴增片段大小為418bp。內(nèi)參β-actin擴增片段長度為315bp，各組電泳條帶沒有發(fā)生任何變化。對于RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在HL-60細胞中核干細胞因子（NS）基因中mRNA表達。

三、討論

核干細胞因子（nucleostemin，NS）[1]是一個正性調(diào)節(jié)蛋白，參與細胞增殖過程。NS不表達于終末分化細胞中，在腫瘤細胞惡性增殖和凋亡逃逸發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)[2，3]，NS通過多條途徑阻礙細胞分化，影響細胞周期，從不同方面促進腫瘤進展。目前，通過對NS基因的更加深入研究，人們對腫瘤的發(fā)生機制有了更深層次的了解，這對腫瘤的診斷、治療及預后評估將產(chǎn)生較深遠的影響。

本研究結(jié)果顯示：通過RT-PCR實驗表明NS基因在HL-60細胞中是高表達狀態(tài)， RT-PCR結(jié)果顯示NS基因在HL-60細胞中表達。也有研究表明[64]，NS可能在細胞周期中干細胞和癌細胞穿越G2/M調(diào)控點的決定方面是一個特異性因子，由于它僅表達于干細胞和惡性腫瘤細胞中，而白血病既是干細胞疾病又是惡性腫瘤，因此在白血病細胞中研究NS基因和NS蛋白也比較合適，而TPT是Topo-Ⅰ的抑制劑，具有廣譜抗腫瘤作用，其作用機制也并不十分完全明了，因此，TPT有可能通過下調(diào)NS基因而達到抗白血病作用可能為其作用機制之一。岳保紅[4]等人研究表明，NS基因在急性白血病中呈高表達狀態(tài)，這種高表達狀態(tài)在研究中得到了證實，表達特點是處于不同分化階段的白血病[5]細胞表達在該基因水平表達高低也有一定的差別，健康人和良性貧血患者沒有發(fā)現(xiàn)該基因的高表達現(xiàn)象。所以白血病[6]是一種造血干細胞的惡性克隆性疾病，它的發(fā)生已被總結(jié)為是一個多基因、多階段、多步驟的發(fā)病過程。

參考文獻

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[6]Philips，R.L， Ernst，R.E， Brunk， B. et al. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science. 2000，288： 1635-1640.