楊洋，吳恩應(yīng)，陳玉琴，劉愛和，吳灼斌，林桓旭，黃偉榮，李彬，郭采平

深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司 藥物研發(fā)中心，廣東 深圳 518107

人巨細胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是皰疹病毒科β屬的DNA病毒，在人群中傳播廣泛，我國成人的感染率超過95%，且巨細胞病毒的感染與地區(qū)、年齡、經(jīng)濟狀況相關(guān)[1]。一般成人感染后臨床癥狀較輕或不明顯，但孕婦感染后可引起胎兒流產(chǎn)、死胎、先天性畸形及智力低下，還可導(dǎo)致器官移植等免疫功能低下的患者死亡[2-4]。因此，巨細胞病毒感染的早期快速診斷對控制巨細胞病毒傳播、促進優(yōu)生優(yōu)育、降低器官移植患者死亡率有重要意義。我們采用間接ELISA法研制了巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒，對其性能進行了驗證，為該試劑盒制定企業(yè)注冊標準和確定生產(chǎn)工藝提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人巨細胞病毒抗原、抗人IgG-HRP購自深圳市菲鵬生物股份有限公司；新生牛血清購自武漢三利生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自MP Biomedicals公司；96孔微孔板購自深圳市金燦華公司；TMB、Tween-20購自Amresco公司；巨細胞病毒IgG抗體參考品購自中國食品藥品檢定研究院（標準物質(zhì)編號360004，批號201101，以下簡稱“國家參考品”）；巨細胞病毒IgG抗體企業(yè)參考品為深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司自產(chǎn)（批號20140710，以下簡稱“企業(yè)參考品”）；參比試劑巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司（批號20140606，以下簡稱“參比試劑”）；待考核試劑為巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法），由本公司研制（批號20140701、20140702、20140703，以下簡稱“待考核試劑”）；第三方試劑巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（增強化學(xué)發(fā)光免疫分析法）購自北京泰格科信生物科技有限公司（批號20140603，以下簡稱“第三方試劑”）；其余普通化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗樣本來源于深圳市第二人民醫(yī)院、深圳市衛(wèi)光生物制品股份有限公司單采血漿站。MK3酶標儀購自Thermo公司；PW-960全自動酶標洗板機購自深圳匯松公司；MB-1酶標板脫水機購自北京天石醫(yī)療公司；DK-600電熱恒溫水浴箱購自上海精宏公司；KBF.720恒溫恒濕箱購自德國賓得公司。

1.2 HCMV IgG的檢測

將待檢樣品按1∶101稀釋，即取待測樣品10 μL至1000 μL樣品稀釋液中，充分混勻，每孔加100 μL；設(shè)立空白對照2孔（從加底物開始實驗），陰性對照、陽性對照和臨界對照各2孔；覆蓋封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完畢的反應(yīng)板，棄去封板膜；洗板機洗板4次，300 μL/孔，浸泡20 s，干板；每孔加入酶結(jié)合物100 μL（空白對照孔除外），覆蓋封板膜，置37℃孵育30 min；取出已孵育完畢的反應(yīng)板，棄去封板膜，洗板4次，干板；加入100 μL TMB顯色液（包括空白對照孔），輕輕振蕩混勻；覆蓋封板膜，置37℃避光孵育15 min；每孔加入100 μL終止液終止反應(yīng)；終止后30 min內(nèi)用酶標儀讀取吸光度值，取單波長450 nm或雙波長450 nm/630 nm測量。

1.3 HCMV IgG檢測試劑盒的性能驗證

1.3.1 技術(shù)指標 依據(jù)中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑（盒）》和《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》，對試劑盒的外觀、陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、重復(fù)性、檢測限、批間差進行檢測[6-7]。

1.3.1.1 外觀 試劑盒外包裝應(yīng)完整，無破損；各組分應(yīng)齊全、完整，液體應(yīng)密封無泄漏；酶標板條應(yīng)平整、無飛邊、表面光潔度好、底部無波紋及劃傷；液體組分應(yīng)澄清透明，無絮狀物；標識應(yīng)清晰，易識別。

1.3.1.2 陽性參考品符合率 對10份陽性參考品進行檢測，其結(jié)果應(yīng)不得出現(xiàn)假陰性。

1.3.1.3 陰性參考品符合率 對5份陰性參考品進行檢測，其結(jié)果應(yīng)不得出現(xiàn)假陽性。

1.3.1.4 重復(fù)性 用重復(fù)性參考品重復(fù)檢測10次，CV應(yīng)≤15.0%。

1.3.1.5 檢測限 對3份最低檢出限參考品進行檢測，應(yīng)均能檢出。

1.3.1.6 批間差 用3個批號的試劑盒分別對國家參考品L1、R、N1（強陽、弱陽、陰性）、企業(yè)參考品l1、r、n1（強陽、弱陽、陰性）進行測定，各10個復(fù)孔，計算30次結(jié)果的吸光度值值均數(shù)、標準差（SD）及變異系數(shù)（CV值）。

1.3.2 對比實驗研究 用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）與珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司的巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）同時檢測1050例樣本，進行對比實驗研究[8-12]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。求出χ2檢驗、一致性系數(shù)Kappa值（κ），考察評價試劑與參比試劑檢測結(jié)果的一致性及是否具有統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

2 結(jié)果

2.1 技術(shù)指標的驗證

20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測10份陽性參考品（國家參考品，P1～P10），準確性（陽性符合率）均為100%；3批試劑盒分別檢測5份陰性參考品（國家參考品，N1～N5），特異性（陰性符合率）均為100%；重復(fù)性CV值分別為1.7%（20140701批）、4.9%（20140702批）和 4.8%（20140703批）；批間變異系數(shù)分別為3.9%（強陽性）、7.2%（弱陽性）和5.3%（陰性），均小于等于15.0%；3份最低檢出限國家參考品L1、L2、L3均能檢出，且均為陽性。

20170701、20170702、20170703批試劑盒檢測10份陽性參考品（企業(yè)參考品，p1～p10），準確性（陽性符合率）均為100%；3批試劑盒分別檢測5份陰性參考品（企業(yè)參考品，n1～n5），特異性（陰性符合率）均為100%；重復(fù)性CV值分別為4.6%（20140701批）、3.6%（20140702批）和 1.9%（20140703批），批間變異系數(shù)分別為5.9%（強陽性）、5.9%（弱陽性）和6.1%（陰性），均小于等于15.0%；3份最低檢出限參考品L1、L2、L3均能檢出，且均為陽性。

以上技術(shù)指標均符合中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑（盒）》、《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》的要求。同時，將20140701、20140702、20140703批試劑盒送中國食品藥品檢定研究院檢定，所檢技術(shù)指標項目全部合格。

2.2 對比實驗研究

用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒與已上市的珠海海泰巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）（國食藥監(jiān)械（準）字2013第3400423號）對1050份血清標本進行檢測，可疑樣本未進入計算。表4給出了診斷試驗中常用的評價指標，本公司試劑盒的陽性符合率為98.92%（95%置信區(qū)間：98.18%～99.66%），陰性符合率為98.60%（95%置信區(qū)間：97.24%～99.96%），與已上市試劑盒的總符合率為98.83%（95%置信區(qū)間：98.17%～99.49%），假陽性率為1.40%，假陰性率為1.08%，陽性試驗的預(yù)示值為99.46%，陰性實驗的預(yù)示值為97.24%，Youden指數(shù)為0.9752，Kappa系數(shù)為 0.9710，一致性優(yōu)，配對χ2檢驗的P＞0.05，待考核試劑和對比試劑的檢測結(jié)果不一致部分不存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異。

1050例樣本中，結(jié)果不一致的樣本共有23例（其中13例第三方試劑與評價試劑測定結(jié)果一致，7例第三方試劑與對比試劑測定結(jié)果一致）。推斷其原因可能是樣本中巨細胞病毒IgG抗體含量位于待考核試劑最低檢出限附近，同時樣本和稀釋液沒有充分混勻，加樣后讀取試驗結(jié)果的時間較早所致。

表1 國家參考品驗證結(jié)果

表2 批間變異系數(shù)檢測結(jié)果（n=30）

表3 企業(yè)參考品驗證結(jié)果

表4 2種試劑盒檢測1050例樣本的結(jié)果

3 討論

檢測巨細胞病毒IgG抗體的免疫學(xué)方法有中和試驗、補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗、酶聯(lián)免疫法、放射免疫法等[13]，但只有酶聯(lián)免疫法具備操作簡便、靈敏度高、特異性好、技術(shù)成熟的優(yōu)點，且用于常規(guī)實驗室[14-15]。

本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）按中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準《YY/T 1183-2010酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑（盒）》、《YY/T 1236-2014巨細胞病毒IgG/IgM抗體檢測試劑（盒）》對國家參考品和企業(yè)參考品進行檢測，各項指標均合格。珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司的酶聯(lián)免疫法試劑盒的有效性已經(jīng)得到國內(nèi)權(quán)威部門的認可，很多研究都使用該試劑盒做比對試驗[16-17]，顯示了其較好的性能，可信度高。在本次對比研究中，收集血清樣本1050例，使用本公司研制的巨細胞病毒IgG抗體檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）與珠海經(jīng)濟特區(qū)海泰生物制藥有限公司的巨細胞病毒IgG抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）分別測定樣本中巨細胞病毒IgG抗體，χ2檢驗的P＞0.05，待考核試劑與對比試劑檢測不一致的部分不存在統(tǒng)計學(xué)意義上的差異，一致性分析Kappa系數(shù)為0.9710，表明一致性優(yōu)（κ＞0.75，表明一致性優(yōu)；κ在0.40～0.75之間為一致性良好；κ＜0.4則表示一致性較差），即2種試劑盒有高度的一致性，有臨床應(yīng)用價值，對相關(guān)疾病可以提供有效的診斷和治療依據(jù)。此外，可以依據(jù)中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準《干擾實驗指南WS/T 416-2013》、《弓形蟲、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒抗體及G型免疫球蛋白抗體親和力檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》完成交叉、干擾實驗，完善分析性能評估資料。

連續(xù)研制3批試劑盒，經(jīng)以上性能評估，各批產(chǎn)品檢測結(jié)果符合相關(guān)要求和規(guī)定，可為完善試劑盒的產(chǎn)品技術(shù)要求和產(chǎn)品說明書提供指引。