陳美伶，姜玉松

（重慶文理學(xué)院特色植物研究院，重慶 402160）

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，可以與靶基因啟動(dòng)子的順式作用元件相結(jié)合，增強(qiáng)或抑制下游基因的表達(dá)，以調(diào)控其轉(zhuǎn)錄效率，在植物生長發(fā)育、激素調(diào)控、生物與非生物逆境脅迫應(yīng)答過程中扮演了極其重要的角色[1-2]。1996 年 Souer等[3]從矮牽牛中成功克隆出第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，之后相繼發(fā)現(xiàn)了矮牽牛的NAM基因、擬南芥的ATAF 1/2和CUC2基因[4]，并取其首字母命名為NAC。NAC類轉(zhuǎn)錄因子具有一個(gè)相同的結(jié)構(gòu)特征，即其N端為高度保守區(qū)，含約150個(gè)氨基酸殘基組成的NAC結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是由A、B、C、D、E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[5]，C端為高度變異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，部分具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)[6]。不同NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育過程中的功能也不盡相同。研究表明，大豆GmNAC20可以調(diào)控生長素信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)，影響植物側(cè)根發(fā)育[7]；擬南芥ANAC092能誘導(dǎo)與植株衰老相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，從而加速葉片衰老的進(jìn)程[8]。此外，NAC轉(zhuǎn)錄因子還參與了植物激素調(diào)控、抗逆境脅迫應(yīng)答的過程。水稻SNAC2基因的超表達(dá)能顯著提升植株對(duì)脫落酸（ABA）的敏感度[9]；擬南芥ATAF1、ANAC019和ANAC072/RD26等能誘導(dǎo)植株抗旱、抗鹽、抗枯萎病基因的表達(dá)，其超表達(dá)能顯著提高植株抗非生物與生物逆境脅迫應(yīng)答的能力[10-12]；Hu等成功克隆了水稻抗旱耐鹽基因SNAC1，同時(shí)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使轉(zhuǎn)基因植株具有強(qiáng)抗旱性[13]。目前，NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能在擬南芥、水稻、大豆、玉米等模式植物中的研究已較為深入，然而關(guān)于生姜NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究還較為少見。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）又名地辛、百辣云，是姜科多年生草本植物姜的新鮮根莖[14]，具有藥食兩用的特點(diǎn)，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。本研究基于生姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以西南竹根姜（Z.officinale Roscoe cv.Southwest）為材料，利用RT-PCR法克隆ZoNAC17，同時(shí)采用數(shù)字表達(dá)譜分析ZoNAC17在生姜不同組織的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步探索ZoNAC17轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)生姜生長發(fā)育、抗逆性應(yīng)答過程的機(jī)理，以及通過基因工程改良作物品質(zhì)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為西南竹根姜，于2017年5月播種于重慶文理學(xué)院特色植物研究院溫室大棚（土壤濕度25%、溫度25℃、光照強(qiáng)度3 500 Lx、光照12 h）培養(yǎng)。約2個(gè)月后，主莖第一次長出側(cè)枝時(shí)，取其側(cè)枝基部，即發(fā)育初期的根莖；約3個(gè)月后，第一側(cè)枝又長出側(cè)枝時(shí)，取第一側(cè)枝的基部，即發(fā)育期的根莖；約4個(gè)月后，生姜第二側(cè)枝又長出側(cè)枝時(shí)，取第一側(cè)枝的基部，即成熟根莖；同時(shí)取生姜主莖從下往上第三片葉子，即成熟葉片；取生姜主莖第三片葉子對(duì)應(yīng)的莖部，即成熟地上莖。將上述收集的所有生姜組織置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 采用Trizol（Invitrogen，美國）進(jìn)行生姜根莖總RNA的提取，RNA的完整性經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，置于-70℃冰箱中保存。以上述提取的生姜根莖總RNA為模板，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Roche，瑞士）合成生姜第一鏈cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生姜ZoNAC17基因的克隆 基于生姜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，利用DNAMAN軟件中的Premier設(shè)計(jì)引物（F：5′-GACCTCGATCAACGGTTGA C-3′；R：5′-AATTCAGCGTGCAACTTTTACTG-3′），并交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。以生姜根莖cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為 25 μL：Taq mix（Biomed，北京）12.5 μL，Primer-F 0.75 μL，Primer-R 0.75 μL，模板 cDNA 0.1 μL，ddH2O 11 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸3 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠，調(diào)節(jié)電壓至3～5 V/cm（約100 V）進(jìn)行電泳檢測，觀察結(jié)果。

在紫外燈下用刀片切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠片，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，再用Gel Extraction Kit試劑盒（Omega，美國）進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。將回收的PCR產(chǎn)物純化后，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp抗生素的平板篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定成功后，選取陽性克隆送往蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 ZoNAC17基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 5.0分析ZoNAC17的氨基酸序列，利用ExPASy的ProtParam功能（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測其分子量、等電點(diǎn)等理化屬性，利用BaCelLo（http：//gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，利用SignalP 4.1服務(wù)器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）分別對(duì)ZoNAC17的信號(hào)肽序列和功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在線預(yù)測。從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載同源性較近的其他物種來源的NAC17序列，同時(shí)運(yùn)用MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采取鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進(jìn)行1 000次Bootstrap計(jì)算構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析生姜NAC17基因和其他物種NAC17基因的親緣關(guān)系。

1.2.4 ZoNAC17基因的表達(dá)分析 分別提取生姜的根莖（發(fā)育初期、發(fā)育期、成熟期）、地上莖（成熟期）、葉片（成熟期）的總RNA，根據(jù)Illumina公司的流程構(gòu)建不同組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)庫，以Bowtie 2.0軟件（http：//bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml）將每個(gè)RNASeq數(shù)據(jù)庫中的Reads與ZoNAC17序列映射，映射到ZoNAC17序列的Reads數(shù)目可粗略反映不同組織樣本的表達(dá)水平，采用FPKM（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）算法對(duì)Reads數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理[15]，得到ZoNAC17在發(fā)育初期根莖、發(fā)育期根莖、成熟根莖、成熟地上莖、成熟葉片5個(gè)處理樣本中的表達(dá)圖譜，每個(gè)處理均包含3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZoNAC17基因克隆及基本理化屬性分析

利用設(shè)計(jì)合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測在約2 000 bp處有一條帶，切膠回收純化該片段，TA克隆后進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示其大小為2 014 bp（圖1）。利用DNAMAN 5.0對(duì)測得序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示ZoNAC17基因全長2 014 bp，包括 57 bp 5′-UTR（非編碼區(qū)）、142 bp 3′-UTR和1 815 bp ORF（開放閱讀框），編碼604個(gè)氨基酸殘基（圖2）。利用ProtParam預(yù)測生姜ZoNAC17分子量為67.52 kD，等電點(diǎn)為4.59，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為47.21，脂肪系數(shù)為70.40，其總平均疏水性為-0.478，為不穩(wěn)定的親水蛋白。采用BaCelLo進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，推測ZoNAC17定位于細(xì)胞核。

圖1 生姜ZoNAC17 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖2 生姜ZoNAC17完整ORF及編碼氨基酸序列

2.2 ZoNAC17轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征分析

通過在線服務(wù)器SignalP 4.1對(duì)ZoNAC17氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測分析，結(jié)果顯示生姜ZoNAC17不含信號(hào)肽（圖3，封二）。用SMART預(yù)測其功能結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白含有1個(gè)低度復(fù)雜區(qū)LCR（Low complexity region，第1～13位），1個(gè)NAM功能結(jié)構(gòu)域（第30～156位），1個(gè)跨膜螺旋區(qū)（Transmembrane region，第569～591位，圖4，封二）。

圖3 生姜ZoNAC17轉(zhuǎn)錄因子的信號(hào)肽分析

圖4 生姜ZoNAC17的結(jié)構(gòu)域

2.3 ZoNAC17基因的同源性分析

在NCBI中查找并下載同源性較高的其他物種NAC17序列，采用MEGA 5.0軟件將生姜NAC17序列與核桃（Juglans regia）、葡萄（Vitis vinifera）、蘋果（Malus domestica）、西葫蘆（Cucurbita pepo）、大豆（Glycine max）、牽牛（Ipomoea nil）、煙草（Nicotiana tomentosiformis）、小果野蕉（Musa acuminata）、菠蘿（Ananas comosus）、油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）的NAC17序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖5）顯示，生姜NAC17基因與來源于單子葉植物小果野蕉、菠蘿、海棗和油棕的NAC17基因聚成一類，與雙子葉植物核桃、葡萄、蘋果、西葫蘆、大豆、牽牛、煙草的NAC17基因分屬兩個(gè)明顯不同的亞族。其中，生姜ZoNAC17和小果野蕉MaNAC17同源性最高，在進(jìn)化上屬于同一個(gè)分支，分子進(jìn)化最近，親緣關(guān)系最為密切。

圖5 生姜ZoNAC17的進(jìn)化樹分析

2.4 ZoNAC17基因的表達(dá)圖譜

利用數(shù)字表達(dá)譜法分析ZoNAC17基因在生姜不同組織的表達(dá)圖譜，結(jié)果（圖6）表明ZoNAC17在生姜根莖、地上莖、葉片中均有較強(qiáng)表達(dá)，且在成熟組織中表現(xiàn)為地上莖＞葉片＞根莖；在生姜根莖的生長發(fā)育過程中，ZoNAC17表達(dá)量表現(xiàn)為發(fā)育期＞成熟期＞發(fā)育初期。

圖6 生姜不同組織ZoNAC17基因的表達(dá)圖譜

3 結(jié)論與討論

NAC轉(zhuǎn)錄因子家族廣泛分布于植物基因組中，植物細(xì)胞通過多種信號(hào)途徑將外界信號(hào)傳遞給相關(guān)應(yīng)答的NAC轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子通過與應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件結(jié)合，激活應(yīng)答基因表達(dá)以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程激素調(diào)控、脅迫應(yīng)答以及誘導(dǎo)寄主對(duì)病原菌侵染產(chǎn)生抗性等各種生理活動(dòng)[16]。本研究成功克隆了一個(gè)生姜的ZoNAC17基因，發(fā)現(xiàn)其N-末端具有一個(gè)典型的高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域。生姜ZoNAC17的N-末端不具有信號(hào)肽，但C端有一個(gè)跨膜螺旋區(qū)，說明生姜ZoNAC17不是分泌蛋白，而是一個(gè)跨膜蛋白，位于細(xì)胞和外界的交界處，能夠影響細(xì)胞與外界間的信號(hào)傳導(dǎo)、營養(yǎng)物質(zhì)交換等生理過程[17]。相關(guān)研究也已證實(shí)，跨膜NAC轉(zhuǎn)錄因子由于具有膜結(jié)合的特征，能夠使其對(duì)突如其來的外界環(huán)境變化迅速作出反應(yīng)，對(duì)植株生長發(fā)育、激素調(diào)控及逆境應(yīng)答等相關(guān)過程具有重大意義[18]。

NAC17轉(zhuǎn)錄因子可以明顯分為單子葉植物來源與雙子葉植物來源兩類，同為單子葉植物的生姜屬于姜科而小果野蕉屬于芭蕉科，從分類學(xué)角度看二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但本研究結(jié)果顯示生姜ZoNAC17與小果野蕉MaNAC17的親緣關(guān)系最近，說明Nr數(shù)據(jù)庫中關(guān)于姜科NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究較為少見，本研究克隆到的ZoNAC17的序列豐富了生姜甚至姜科植物的基因庫。NAC基因的表達(dá)具有組織特異性，陸地棉GhNAC7[19]在花、子葉和真葉中有較高表達(dá)，莖、根、花藥中表達(dá)較少。ZoNAC17在生姜不同組織均有較強(qiáng)表達(dá)，且在不同成熟組織中的表達(dá)量也有所差異，地上莖中表達(dá)量最高，葉片次之，根莖最少。在生姜發(fā)育過程中，ZoNAC17表達(dá)量先增加后逐漸減少，且在發(fā)育期表達(dá)量最高，這一結(jié)果與玉米ZmNACx[20]、擬南芥AtNAC2[21]在各個(gè)發(fā)育時(shí)期與發(fā)育器官的表達(dá)規(guī)律相一致。

綜上所述，本研究成功克隆了ZoNAC17基因，其為親水性較強(qiáng)的跨膜蛋白，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核，與小果野蕉親緣關(guān)系最近，且在生姜不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度均存在著顯著差異。本試驗(yàn)結(jié)果為今后進(jìn)一步探索ZoNAC17在調(diào)控生姜生長發(fā)育、抗逆境脅迫應(yīng)答等過程中的功能以及作為候選基因用于改良生姜抗逆性的研究奠定了基礎(chǔ)。