阮 楊 王東升 郭世偉 凌 寧? 沈其榮

（1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化高新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）(2 南京市蔬菜科學(xué)研究所，南京 210042）

西瓜是我國重要經(jīng)濟(jì)作物，但因連作導(dǎo)致土傳病害頻發(fā)，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。西瓜枯萎病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重、防治困難的典型土傳病害［1］。Janvier等［2］研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的破壞是誘發(fā)土傳病害的主要原因［3］。當(dāng)前，嫁接被廣泛用于防控西瓜枯萎病。嫁接能夠改變根系分泌物的組成，并通過分泌抑菌物質(zhì)，組建健康的根際微生物群落，在根際形成化學(xué)屏障和生物屏障，有效抵抗病原菌入侵［4］。

土壤空間異質(zhì)性導(dǎo)致不同類型土壤的微生物群落存在差異。Edwards等［5］研究表明，不同土壤上種植的水稻根際微生物群落顯著改變。Peiffer等［6］也指出，不同地點(diǎn)玉米的根際微生物群落明顯不同。吉林、海南、江蘇、新疆分別位于我國北部、南部、東部和西部地區(qū)，地處不同氣候類型帶，土壤理化差異較大，且均為西瓜生產(chǎn)大省。因此，研究不同地區(qū)土壤上砧穗互作對根際微生物活性的影響不僅有利于綜合了解不同西瓜種植地土壤微生物代謝活性現(xiàn)狀，還可以探究嫁接對微生物活性的影響在不同土壤類型上是否存在普遍規(guī)律。

微生物的種類和特性決定了微生物對碳源的代謝能力［7］，研究微生物功能多樣性能夠了解環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化［8］。Biolog技術(shù)通過監(jiān)測微生物對單一能源碳的利用程度和變化，來反映微生物群體代謝特征。因其操作簡單、靈敏度高和分辨力強(qiáng)而被廣泛用于微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性研究［9］。目前，大量研究從根系分泌物和根際微生物群落組成來探究嫁接對根際微生物的影響，但對不同土壤、不同嫁接植物根際微生物碳代謝活性方面研究較少。本研究通過盆栽實(shí)驗(yàn)，在四種類型土壤上種植不同嫁接處理的植株，利用Biolog培養(yǎng)技術(shù)，探究不同土壤類型和嫁接方式對作物根際微生物碳代謝活性的影響，以期找到微生物碳源代謝與嫁接抗病的關(guān)系，為研究嫁接對西瓜枯萎病的抗性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

分別從吉林、海南、江蘇和新疆四個省份采集土壤表層土（0 ～ 20cm）。風(fēng)干后，過100目篩，進(jìn)行基本理化性質(zhì)測定。土壤pH和電導(dǎo)率用無CO2水以1︰2.5土水比測定，土壤總碳、全氮使用元素分析儀（Vario EL Ⅲ，elementar）測定，有效磷用碳酸氫鈉法測定，速效鉀用乙酸銨法測定。樣地土壤基本情況見表1。植株類型分別為自根葫蘆、自根西瓜、嫁接西瓜（葫蘆砧木）和嫁接葫蘆（西瓜砧木）。葫蘆品種為瓠子(Lagenaria siceraria(Molina) Standl. var. hispida (Thunb.) Hara)，西瓜品種為早佳8424（Citrullus lanatus (Thunb.)Matsum. and Nakai var.Zaojia 8424）。嫁接方法采用插接法［10］，所有植株幼苗均由南京市蔬菜科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年7月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓試驗(yàn)基地進(jìn)行。具體如下：4個地點(diǎn)土樣過10目篩，去除碎石、根等雜物。將土裝入盆缽中，每盆土重約480 g。將植株幼苗根部清洗干凈，移栽到盆缽中。期間適當(dāng)澆水。種植45 d后采集樣品，抖落根表松軟的土，將緊緊附著在根表的土視為根際土。根和根際土一并放入冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

BIOLOG生態(tài)板（ECO MICROPLATE Cat.No. 1506 HAYWARD, CA 94545 U.S.A）包含用于土壤微生物群落分析最常用的31種碳源，每種碳源設(shè)有3個平行。具體方法為，稱取根和根際土共1 g于無菌50 ml離心管中，加入9 ml滅菌的0.85%NaCl溶液，放入搖床中250 rmin-1震蕩30 min，取出后靜置10 min，吸取2 ml上清液稀釋至1 000倍。吸取稀釋液接種到BIOLOG板中，每孔150 μl，放入恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)［11］。使用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)（BIOLOG MicroStation, USA）每隔12 h測定590 nm和750 nm波長下的吸光值，持續(xù)測量至168 h。

表1 供試土樣采樣地點(diǎn)和理化性質(zhì)Table 1 Sampling sites and physicochemical properties of the soils tested

1.3 數(shù)據(jù)分析

微生物代謝活性用590 nm吸光度數(shù)值減去750 nm吸光度數(shù)值表示［8］。

平均每孔顏色變化（Average well color development, AWCD）代表微生物對碳源的綜合代謝能力［11］。

式中，Ai為第i個孔的相對吸光度，A1為對照孔的相對吸光度。

選取培養(yǎng)過程中第96小時測定的吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析［12］。不同植物處理微生物的碳源利用單因素方差分析使用SPSS 19.0。使用R 3.3.3版本中的vegan、ggplot2程序包完成微生物碳源吸光度主成分分析，使用R 3.3.3版本中的permute、lattice、vegan、pheatmap程序包完成熱圖分析，使用R2.10.1版本的lattice、gbmplus程序包完成聚類推進(jìn)樹（Aggregated boosted tree, ABT）分析。

2 結(jié) 果

2.1 微生物碳代謝活性差異

不同土壤類型（p＜0.001）和不同植物類型處理之間（p= 0.047）AWCD值存在顯著差異（圖1A）。土壤處理中吉林黑土微生物碳源代謝活性最高、江蘇黃棕壤次之、新疆灰漠土和海南磚紅壤最低。不同土壤上4種嫁接處理AWCD值呈現(xiàn)不同的變化趨勢。四種土壤自根西瓜處理的AWCD值均大于自根葫蘆處理。與自根西瓜處理相比，黑土處理的嫁接西瓜（葫蘆砧木）AWCD值顯著降低，而其余土壤上嫁接處理AWCD值沒有顯著變化。

由不同嫁接處理根際微生物對六大類碳源利用程度（圖1B）可知，根際微生物對糖類、氨基酸類、酯類碳源的利用程度存在顯著差異，但對醇類、胺類和酸類碳源利用差異不顯著。4種嫁接處理微生物對六類碳源的利用程度有相同趨勢。自根葫蘆處理根際微生物碳源利用性最低，自根西瓜處理最高，兩種嫁接植物根際微生物碳代謝活性處于中間水平。

2.2 土壤類型和植物類型對碳源利用的影響

31種碳源吸光度數(shù)據(jù)的多因素置換方差分析（Permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA）結(jié)果表明（圖2A），土壤類型（R2= 0.534，p＜0.001）和植株類型（R2=0.075，p＜0.001）對微生物碳源代謝均有顯著影響，兩者交互作用（R2= 0.215，p＜0.001）顯著改變微生物碳源代謝水平。

六類碳源吸光度數(shù)據(jù)方差分析（ANOVA）的結(jié)果表明（圖2B），土壤因素均顯著影響微生物對六類碳源的代謝程度（p值均小于0.001）；不同植物處理之間微生物對糖類（p＜0.05）、氨基酸類（p＜0.001）、醇類（p＜0.05）、胺類（p＜0.001）碳源的利用程度顯著改變，對酯類（p= 0.09）和酸類（p= 0.25）碳源利用的影響不顯著；土壤與植物處理的交互作用同樣顯著影響微生物對六類碳源的利用（p值均小于0.05）。

2.3 不同植物類型根際微生物的碳源利用模式

為了解每種土壤上，不同嫁接處理根際微生物碳代謝差異，對31種單一碳源吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（圖3）?？梢钥闯觯煌藿犹幚砀H微生物對31種碳源的利用在主成分第一、二軸上分開（黑土p= 0.001、黃棕土p= 0.001、磚紅壤p=0.001、灰漠土p= 0.003），證明在不同土壤上，嫁接均改變根際微生物碳源利用模式。

2.4 不同根際微生物碳代謝指紋差異

為進(jìn)一步探究嫁接對根際微生物碳代謝活性的影響，將31種單一碳源的代謝吸光度數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行熱圖分析（圖4）。結(jié)果表明，自根葫蘆處理不同碳源利用總體上呈藍(lán)色或深藍(lán)色，證明其根際微生物對大部分單一碳源利用程度相對偏低，對α-D-乳糖、I-赤藻糖醇、γ-羥基丁酸、衣康酸、α-丁酮酸等少數(shù)碳源利用程度較高；相反，自根西瓜處理大部分碳源代謝呈橘紅色或紅色，說明其根際微生物對多種碳源均有較高利用程度。嫁接西瓜（葫蘆砧木）與自根西瓜處理相比，微生物對糖類（D-木糖、肝糖）、氨基酸類（除L-精氨酸以外其他氨基酸）、酯類（吐溫40、吐溫80）、醇類（I-赤藻糖醇、D-甘露醇、D, L-α-甘油）和胺類（苯乙基胺、腐胺、N-乙?；?D-葡萄胺）碳源的利用程度普遍降低，而在對酸類碳源的利用程度上，嫁接西瓜（葫蘆砧木）處理增加了對D-半乳糖醛酸、衣康酸的利用，對2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和D-蘋果酸的利用程度降低。嫁接葫蘆（西瓜砧木）處理根際微生物對碳源的綜合利用程度高于自根葫蘆和嫁接西瓜（葫蘆砧木）處理。與自根西瓜處理相比，嫁接葫蘆（西瓜砧木）處理根際微生物對氨基酸類碳源的利用程度（除L-絲氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸）增加；除4-羥基苯甲酸、γ-羥基丁酸外其他酸類碳源的利用程度均有所提高；糖類、酯類、醇類和胺類碳源的利用略有降低。

圖1 4種土壤4種根際微生物碳源代謝吸光度（A）及4種根際微生物利用6類碳源的吸光度（B）Fig. 1 AWCD of carbon sources utilization by microorganisms in rhizosphere relative totreatment (A) and relative to kind of carbon sources (B)

圖2 微生物對31種單一碳源利用吸光度的PERMANOVA分析（A）及六類碳源利用吸光度方差分析（B）Fig. 2 PERMANOVA of absorbance relative to sole carbon sources utilized by microorganisms (A) and ANOVA of absorbance relative to kind of carbon sources utilized (B)

圖3 不同植物類型根際微生物碳源利用主成分分析Fig. 3 PCA of carbon sources utilization by microorganisms relative to type of plant

2.5 環(huán)境因子對微生物碳代謝活性的影響

將31種碳源代謝吸光度數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析后，取PC1軸數(shù)據(jù)代表微生物對碳源的綜合利用水平，與環(huán)境因子進(jìn)行聚類推進(jìn)樹分析（圖5）。結(jié)果表明，土壤速效鉀和有效磷對微生物碳源代謝的相對影響率最高，分別為27.3%和26.9%；其次是土壤電導(dǎo)率和pH，分別為21.8%和16.6%；而土壤全氮量、全碳量和土壤碳氮比對微生物活性的影響較小，分別為3.2%，2.3%和1.9%。

六類碳源的代謝吸光度與不同環(huán)境因子的ABT分析表明，土壤有效磷和速效鉀很大程度上影響微生物對糖類、氨基酸類、酯類、胺類及酸類碳源的代謝利用。土壤全氮和pH主要影響微生物對醇類物質(zhì)的代謝（分別為31.0%和28.9%）。

3 討 論

3.1 不同土壤根際微生物碳代謝指紋特征與差異

不同土壤類型處理中，吉林黑土的微生物帶謝活性最高，江蘇黃棕壤次之，海南磚紅壤、新疆灰漠土最低。原因是黑土的肥力高，pH近中性，環(huán)境適宜微生物生存，微生物多樣性水平高。而磚紅壤屬酸性土，土壤養(yǎng)分含量少，微生物數(shù)量和活性均被抑制。新疆灰漠土土壤電導(dǎo)率顯著高于其他三種土壤，土壤電導(dǎo)率與含鹽度呈正相關(guān)關(guān)系，高鹽分抑制微生物的生長［13］。

圖4 不同植物類型根際微生物對31種碳源代謝程度熱圖分析Fig. 4 Heatmap analysis ofmetabolisms of 31 sole carbon sources by rhizospheric microorganisms relative to type of plant

聚類推進(jìn)樹分析（圖5）表明，土壤理化因子影響微生物活性。有效磷、速效鉀是影響土壤微生物碳代謝活性的主要因子，pH和全氮主要影響微生物對醇類物質(zhì)的代謝。有研究表明，土壤有效磷、速效鉀、pH和全氮量均顯著影響土壤中微生物數(shù)量［14］。因此可以推斷，理化因子通過改變土壤微生物量進(jìn)而影響微生物對碳源利用能力。

3.2 不同植物根際碳代謝差異及與土傳病害之間的聯(lián)系

前期試驗(yàn)證明，自根葫蘆、自根西瓜和嫁接西瓜（葫蘆砧木）分泌不同的根系分泌物［15］，且分泌物對微生物活性有刺激作用［16］，因此可以推斷，嫁接改變了根系分泌物的組成進(jìn)而影響根際微生物活性。本試驗(yàn)中，嫁接顯著改變了根際微生物代謝活性，不同嫁接處理微生物對糖類、氨基酸類和酯類碳源的利用存在顯著差異，而對醇類、胺類和酸類的利用程度差異不顯著（圖1B），原因是土壤因素對微生物碳源利用的影響遠(yuǎn)大于植物因素（圖2），使部分植物因素的影響效果被掩蓋［7］。主成分分析表明，嫁接顯著改變了根際微生物碳源代謝模式。通過熱圖分析結(jié)果顯示，自根葫蘆處理根際微生物對碳源利用普遍偏低，而自根西瓜處理大部分碳源利用程度高，兩種嫁接處理微生物碳源利用程度處于中間水平。

圖5 環(huán)境因子對微生物碳源利用的相對影響率Fig. 5 Relative influence of environmental factors on carbon sources utilization by microorganisms

根際中的糖類、氨基酸、酸類等物質(zhì)主要來自于根系分泌物［17］。植物將5% ～ 21%的光合產(chǎn)物以根系分泌物的形式釋放到土壤環(huán)境中［18］，為微生物提供物質(zhì)和能量。大量研究表明，根系分泌物中的糖、氨基酸等物質(zhì)能夠?yàn)橥羵鞑≡峁┥姹匾奶荚春偷矗瑢Σ≡纳L和孢子萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用［17，19］。尖孢鐮刀菌是異養(yǎng)微生物，傾向于利用碳氮比高的物質(zhì)。根際環(huán)境中糖類含量高，可為致病菌提供營養(yǎng)。氨基酸參與多種生命過程，是微生物重要的營養(yǎng)源之一，對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和活性均有直接影響。前人研究表明，外源添加丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸對尖孢鐮刀菌的生長有明顯的刺激作用［17］。潘凱和吳鳳芝［20］以5種對枯萎病不同抗性黃瓜品種為實(shí)驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)其根系分泌物中總氨基酸水平與品種抗性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)的西瓜品種早佳8424屬于感病品種，從根系分泌物中檢測出大量糖和氨基酸［17］。與其他植物處理相比，自根西瓜處理根際微生物對糖類、氨基酸類碳源代謝水平高（圖4）。因此，根際微生物對糖類、氨基酸類利用水平可能與枯萎病抗性存在一定關(guān)系。此外，酚酸作為根際中重要的化感物質(zhì)，對土傳病原尖孢鐮刀菌的生長有很大影響。外源添加2-羥基苯甲酸在低濃度時促進(jìn)孢子萌發(fā)，高濃度對孢子萌發(fā)起抑制作用；4-羥基苯甲酸對尖孢鐮刀菌產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用［17］。本研究中，自根西瓜處理的根際微生物對4-羥基苯甲酸代謝活性高，自根葫蘆處理微生物對4-羥基苯甲酸代謝活性較低，砧穗互作降低了根際微生物對4-羥基苯甲酸的利用程度，這可能與嫁接之后植物向根際分泌4-羥基苯甲酸的量減少有關(guān)。

連作障礙是由根系分泌物介導(dǎo)下植物與微生物共同作用的結(jié)果［21］。植物通過分泌根系分泌物影響微生物的碳代謝活性，自根西瓜處理微生物碳源綜合利用程度高，證明根際環(huán)境碳源種類豐富，能夠?yàn)椴≡L提供有利條件，可能誘導(dǎo)枯萎病產(chǎn)生；相反，自根葫蘆根際環(huán)境中碳源物質(zhì)相對貧乏，不利于病原菌大量繁殖。通過嫁接，改變了植物根系分泌物的組成，降低了根際微生物對部分碳源的代謝活性。嫁接西瓜（葫蘆砧木）處理與自根西瓜相比，根際的微生物對碳源（尤其是糖類和氨基酸類）的利用普遍降低（圖 4），在一定程度上解釋了嫁接防控土傳病害的原因。而嫁接葫蘆（西瓜砧木）處理，對糖類、氨基酸類碳源的代謝程度仍處于較高水平，證明西瓜作為砧木不能達(dá)到病害防控的目的。

4 結(jié) 論

土壤類型和砧穗互作均顯著改變微生物碳源代謝活性，土壤類型對微生物活性的影響更大。四種土壤處理中，吉林黑土微生物代謝水平最高，海南紅壤和新疆灰漠土最低。土壤速效鉀、速效磷養(yǎng)分的差異影響微生物對不同類型碳源的代謝活性。不同嫁接處理中，自根西瓜根際微生物代謝程度最高，自根葫蘆最低。嫁接降低了微生物對糖類、氨基酸等有益于病原菌生長物質(zhì)的代謝，表明根際微生物組成和化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，不利于病原菌大量繁殖。