劉真華,曹燦景

(1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,山東 濟(jì)南250100;2.山東工藝美術(shù)學(xué)院,山東 濟(jì)南250014)

紅花檵木 (Loropetalum chinense var.rubrum)又名紅檵木,是檵木 (Loropetalum chinense Oliv.)的變種[1],金縷梅科 (Hamamelidaceae)檵木屬(Loropetalum R.Br.)植物[2]。紅花檵木花葉色彩絢麗,四季景觀變化豐富,兼具適應(yīng)性強(qiáng)、耐修剪與易造型等優(yōu)點(diǎn),是園林綠化廣泛應(yīng)用的彩葉樹種之一。紅花檵木的坐果率低,且用其種子繁殖易出現(xiàn)返祖現(xiàn)象,而扦插是其當(dāng)前繁殖的主要手段。但紅花檵木是木本植物,與草本植物比較,其扦插生根難,生長速度慢、費(fèi)工多、成本高,另外,扦插還受到包括環(huán)境、土壤、季節(jié)等在多種因素的影響[3],從而降低了紅花檵木的繁殖系數(shù),使其難以進(jìn)行工廠化、批量生產(chǎn),不能滿足不斷擴(kuò)大的市場需求[4]。試管內(nèi)微型繁殖 (micro propagation)不受季節(jié)和氣候的影響,不僅可以在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出大量長勢基本一致的優(yōu)質(zhì)脫毒試管苗,還可以實(shí)現(xiàn)苗木的周年生產(chǎn)供應(yīng),有利于珍稀品種和新品種在生產(chǎn)上的迅速推廣應(yīng)用[5]。當(dāng)前,有關(guān)紅花檵木繁殖方面的報(bào)道主要集中在嫩梢枝條扦插[6]、短枝接穗扦插[7]和嫁接[8]等方面,而在微體高效快繁方面雖有報(bào)道,但尚不多見或不成體系。因此,本研究選取紅花檵木的莖段作外植體,從外植體叢芽誘導(dǎo)、叢芽繼代增殖、生根誘導(dǎo)和馴化移栽4個(gè)方面深入探討不同濃度和配比的激素、培養(yǎng)基類型對紅花檵木離體快繁的影響,以期為紅花檵木微體快繁體系的建立、種質(zhì)離體保存提供數(shù)據(jù)參考,為其工廠化批量生產(chǎn)供應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅花檵木當(dāng)年生幼嫩枝條,取自山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院試驗(yàn)站,其母樹株齡約6年,用其莖段做外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將外植體放置于加有2滴洗潔精的水中浸泡30min,用清水沖洗5min,蒸餾水漂洗3-5次。在超凈工作臺(tái)上,用75%的酒精消毒10s,再用無菌水漂洗3-5次;利用0.2%的HgCl2消毒10min,再用無菌水漂洗3-5次,無菌濾紙吸干外植體表面水分。將幼嫩枝條剪切成1.5-2cm的帶節(jié)莖段,放入培養(yǎng)皿備用。

1.2.2 叢芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

以MS為基本培養(yǎng)基,pH值5.8,設(shè)置濃度和配比不同的6-BA與NAA處理9組,其中6-BA濃度依次為0.7mg/L、1.4mg/L和2.1mg/L,NAA濃度依次為0.1mg/L、0.4mg/L和0.7mg/L。以每枝條的第2、3、4節(jié)位的莖段作外植體,利于叢芽誘導(dǎo)。將外植體按頂端優(yōu)勢方向斜插入MS培養(yǎng)基中,莖節(jié)距培養(yǎng)基表面0.1-0.4cm,接種瓶內(nèi)分3排,前3中4后3總計(jì)10個(gè)莖段。每瓶接種10個(gè)莖段,每處理10瓶,每處理重復(fù)3次,放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),30d后觀察并統(tǒng)計(jì)出芽情況。培養(yǎng)箱中溫度設(shè)置為23-25℃,光照強(qiáng)度1 800-2 000Lx,光照時(shí)間為12h/d。

1.2.3 叢芽增殖試驗(yàn)

在叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中選取并切割長度為2-2.5cm的叢生芽,接種到增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基的制備方法為,以 MS為基本培養(yǎng)基,pH值5.8。設(shè)置濃度和配比不同的6-BA與NAA處理6組,其中6-BA濃度依次為0.6mg/L、1.3mg/L和2.0mg/L,NAA濃度依次為0.1mg/L和0.2mg/L。每瓶接種10個(gè)叢芽,每處理5瓶,每處理重復(fù)3次,放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),25d后觀察并統(tǒng)計(jì)出芽情況。培養(yǎng)箱中溫度設(shè)置為23-25℃,光強(qiáng)1 800-2 000Lx,光照時(shí)間為12h/d。

1.2.4 生根培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在增殖培養(yǎng)基中,選取并切割長度為3-4cm的單個(gè)芽苗,接種到生根培養(yǎng)基上后,先在黑暗中培養(yǎng)2-3d,再轉(zhuǎn)入光照條件下培養(yǎng)。生根培養(yǎng)基的制備方法為,以MS或1/2MS為基本培養(yǎng)基,pH值5.8,設(shè)置濃度和配比不同的NAA和IAA處理8組,其中NAA濃度依次為0.4mg/L和0.8mg/L,IAA濃度依次為2mg/L和3mg/L。每瓶接種10個(gè)芽苗,每處理5瓶,每處理重復(fù)3次,放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),30d后觀察并統(tǒng)計(jì)生根情況。培養(yǎng)箱中溫度設(shè)置為23-25℃,光強(qiáng)1 800-2 000Lx,光照時(shí)間為12h/d。

1.2.5 煉苗移栽試驗(yàn)

提高紅花檵木組培苗成活率的關(guān)鍵是栽前煉苗,其次是移栽時(shí)避免傷根和藥液浸根殺菌消毒,再次是栽后水肥管理。其具體做法為:選取組培瓶內(nèi)高3-4cm的帶根健壯試管苗進(jìn)行移栽。移栽前將組培瓶移至室外,前2d松動(dòng)瓶蓋,后5d打開瓶蓋。1周后取出試管苗,用清水洗去附著在根部的瓊脂,注意避免傷根,將根在1 000倍的多菌靈溶液中浸泡2min,取出栽植于事先高溫消毒的基質(zhì)中,每處理1張穴盤,每盤50株,每處理重復(fù)3次。移栽后組培苗異常脆弱,葉片易失水造成植株死亡,要及時(shí)補(bǔ)充肥水以提高成活率。移栽30d后調(diào)查組培苗的成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

利用Microsoft excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對外植體叢芽誘導(dǎo)的影響

不同激素濃度配比對紅花檵木當(dāng)年生幼嫩莖段外植體叢芽誘導(dǎo)的影響不同 (表1)。在6-BA濃度一定時(shí),叢芽誘導(dǎo)率隨NAA濃度 (0.1-0.7mg/L)的增加表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢;在NAA濃度一定時(shí),叢芽誘導(dǎo)率隨6-BA濃度 (0.7-2.1mg/L)的增加呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢。叢芽誘導(dǎo)率以培養(yǎng)基配方MS+6-BA 1.4mg/L+NAA 0.1mg/L條件下最大,達(dá)到90%,其次是MS+6-BA 1.4mg/L+NAA 0.4mg/L處理,誘導(dǎo)率達(dá)到77%。在6-BA 2.1mg/L+NAA 0.1mg/L處理和6-BA濃度1.4mg/L的3個(gè)處理下,叢芽生長致密,其他處理下生長稀疏。

2.2 不同激素配比對叢芽增殖的影響

不同激素濃度配比對紅花檵木叢芽增殖效果影響存在差異 (表2)。在NAA濃度一定時(shí),叢芽增殖數(shù)、增殖系數(shù)、玻璃化數(shù)和玻璃化率均隨6-BA濃度 (0.6-2.0mg/L)的增加表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢,且均在培養(yǎng)基中6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L時(shí)達(dá)到最大值。在6-BA濃度相同條件下,0.1mg/L的NAA處理與0.2mg/L的NAA處理在叢芽數(shù)和增殖系數(shù)上差異較為明顯,而在玻璃化數(shù)和玻璃化率方面差異不明顯,這說明NAA對叢芽增殖的影響較大,對玻璃化的影響不明顯,進(jìn)而表明造成處理間玻璃化差異顯著的主要因素是6-BA。雖然在6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L處理下,紅花檵木叢芽增殖數(shù)及增殖系數(shù)最大,但此時(shí)叢芽玻璃化數(shù)與玻璃化率也最高,所以綜合比較得出叢芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.3mg/L+NAA 0.2mg/L。

表1 兩種激素及其配比對外植體叢芽誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effects of different hormonal formulas on inducing differentiation

表2 兩種激素及其配比對叢芽增殖的影響Tab.2 Effects of different hormonal formulas on proliferation of cluster buds

2.3 不同濃度激素配比和培養(yǎng)基對紅花檵木生根誘導(dǎo)的影響

不同濃度、不同激素及不同培養(yǎng)基的處理,紅花檵木誘導(dǎo)生根數(shù)與生根率調(diào)查結(jié)果見表3。由表3可知,在IBA與IAA濃度相同的MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)基上,紅花檵木誘導(dǎo)生根數(shù)與生根率以1/2 MS培養(yǎng)基高于MS培養(yǎng)基,這表明1/2MS培養(yǎng)基更利于紅花檵木的生根誘導(dǎo)。在IAA濃度相同時(shí),NAA 0.4mg/L處理下生根數(shù)和生根率均大于NAA 0.8mg/L處理,表明NAA濃度0.4mg/L較0.8mg/L更利于紅花檵木生根誘導(dǎo)。在培養(yǎng)基相同條件下,紅花檵木生根數(shù)與生根率均以NAA 0.4mg/L+IAA 3mg/L處理最大,根系長、粗壯且直接來源于莖的根系多,有利于紅花檵木生根誘導(dǎo)及后期的煉苗移栽。由此可知,紅花檵木生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 0.4mg/L+IAA 3mg/L。

表3 兩種激素的不同濃度配比和培養(yǎng)基對紅花檵木生根誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different medium and hormonal formulas on rooting performance

2.4 不同基質(zhì)對紅花檵木組培苗移栽成活率的影響

不同基質(zhì)上,紅花檵木組培苗移栽成活率調(diào)查結(jié)果見表4。由表4可知,不同基質(zhì)對紅花檵木組培苗煉苗移栽成活株數(shù)和成活率影響不同。c處理下紅花檵木組培苗移栽成活株數(shù)和成活率較其他處理高,分別為42株和84%,且植株生長健壯,葉片較為舒展,新根萌發(fā)數(shù)量多;其次是d處理,移栽成活株數(shù)和成活率分別為41株和82%,與c處理差異不顯著;a處理移栽成活株數(shù)和成活率均高于b處理,由此說明,腐殖土較泥炭更適宜于紅花檵木組培苗移栽成活。

表4 不同基質(zhì)對紅花檵木組培苗移栽成活率的影響Tab.4 Effects of different substrates on the transplant survival rate of tissue cultured plantlets

3 結(jié)論與討論

以當(dāng)年生紅花檵木幼嫩枝條莖段為外植體,研究外源激素及培養(yǎng)基類型對其叢芽誘導(dǎo)、叢芽增殖、生根培養(yǎng)的影響和不同基質(zhì)對煉苗移栽的影響。研究結(jié)果表明:紅花檵木幼嫩帶節(jié)莖段作外植體能夠?qū)崿F(xiàn)微體快繁。叢芽誘導(dǎo)率最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.4mg/L+NAA 0.1mg/L,出芽數(shù)和誘導(dǎo)率分別為90個(gè)和90%;叢芽增殖培養(yǎng)基最佳為MS+6-BA 1.3mg/L+NAA 0.2mg/L,叢芽數(shù)和增殖系數(shù)分別為170株和3.4,MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L處理下叢芽數(shù)和增殖系數(shù)雖然最高,但叢芽玻璃化數(shù)及玻璃化率也最高,分別到達(dá)18個(gè)和36%;生根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA 0.4mg/L+IAA 3mg/L,生根數(shù)和生根率最高,分別為45條和90%,且此時(shí)生根量多、根長且健壯;馴化移栽最適宜的基質(zhì)配比為珍珠巖∶蛭石∶泥炭=1∶1∶4,成活株數(shù)為42株,成活率達(dá)到84%,幼苗葉片舒展,生長健壯,新根萌發(fā)數(shù)量多。

外源激素的是影響木本植物芽誘導(dǎo)效果的最主要因素之一[9],其種類、濃度及配比的不同對芽誘導(dǎo)的效果亦存在差異。葉添謀等[10]研究認(rèn)為,B5+6-BA 1.0mg/L+蛋白胨0.1mg/L處理下紅檵木叢芽誘導(dǎo)效果最好,誘導(dǎo)率達(dá)到70%。而本研究表明,在MS+6-BA 1.4mg/L+NAA 0.1mg/L條件下紅檵木叢芽誘導(dǎo)效果最好,誘導(dǎo)率達(dá)到90%,這表明培養(yǎng)基中激素及濃度的不同對其叢芽誘導(dǎo)的效果存在差異。另外,還可以看出6-BA濃度1.4 mg/L的3個(gè)處理叢芽誘導(dǎo)率總體較高,這是因?yàn)?-BA是叢芽誘導(dǎo)的主要外源激素;而6-BA濃度一定時(shí),低濃度的NAA處理下,叢芽誘導(dǎo)率相對較高,這可能是因?yàn)榈蜐舛鹊腘AA與6-BA的協(xié)同作用更佳[11]。

培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素類物質(zhì)易使組培苗產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象[12]。尹恒等[13]研究認(rèn)為,培養(yǎng)基中6-BA濃度大于2mg/L時(shí)紅檵木玻璃化苗大量產(chǎn)生。本研究結(jié)果表明,在6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L處理和6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L處理下,叢芽頂部玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重,玻璃化數(shù)量較其他處理高,本試驗(yàn)結(jié)果與前人一致。

吲哚乙酸 (IAA)是植物體內(nèi)最常見的生長素類物質(zhì),根尖和莖尖產(chǎn)生的IAA運(yùn)輸?shù)缴鶇^(qū),可以促進(jìn)不定根和側(cè)根的形成,因此IAA對不定根的形成有重要作用[14]。本試驗(yàn)條件下,在NAA濃度相同時(shí),IAA 3.0mg/L的處理不定根發(fā)生數(shù)量均高于IAA 2.0mg/L的處理,證明IAA對不定根的形成有重要影響,其原因可能是IAA加快了呼吸鏈的轉(zhuǎn)運(yùn)速度,為莖基部生根提供了足夠的能量[15],因而在一定濃度范圍內(nèi),IAA濃度越高越有利于紅花檵木誘導(dǎo)生根。文清嵐等[16]研究指出,NAA與IAA合理組合較使用一種激素 (NAA或IAA)更利于杉木 (Cunninghamia lanceolata)組培苗生根,并認(rèn)為杉木生根誘導(dǎo)以NAA 0.4mg/L+IAA 0.6mg/L處理效果最好。本研究結(jié)果表明,紅花檵木生根誘導(dǎo)最佳配方為1/2MS+NAA 0.4mg/L+IAA 3.0mg/L,與文清嵐等人在杉木組培苗生根誘導(dǎo)上使用的激素濃度不完全相同,應(yīng)該是因?yàn)椴煌参飳ιT導(dǎo)所需激素濃度存在差異所致。

組培苗移栽成活率和后期生長勢是衡量組培快繁能否規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)條件下,珍珠巖∶蛭石∶泥炭配比為1∶1∶4的處理紅花檵木組培苗成活率達(dá)到84%,且組培苗生長健壯,能夠?qū)崿F(xiàn)紅花檵木離體高效快繁,并用于紅花檵木苗的規(guī)模化生產(chǎn)。另外,c處理和d處理均高于a處理和b處理,這可能是因?yàn)轵问枪杷猁}材料經(jīng)高溫加熱膨脹而成,具有較強(qiáng)的透氣性和保水能力,有利于植物根系的萌發(fā)和生長。