高慶茂,董春燕

(1.萊蕪職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東 萊蕪271100;2.青州市亞泰農(nóng)業(yè)有限公司,山東 青州262501)

金銀花 (Lonicera japonica Thunb.)又名過冬藤、金花和銀華等,是忍冬科 (Caprifoliaceae)常綠多年生藤本植物,野生種分布較為廣泛,常見生于林中、山坡灌叢和道路兩邊[1]。金銀花是重要的傳統(tǒng)中藥材,其藤、莖、葉、花蕾均可入藥,具有清熱解毒、抑菌消炎、止血、抗老化等功效,藥用價(jià)值較高[2]。同時(shí),金銀花的花清香怡人,既可用作園林綠化又可作盆景,是一種珍貴的觀賞植物[3]。傳統(tǒng)的金銀花繁殖方式主要有壓條、扦插、分株、嫁接和種子繁殖等,不僅育苗周期長、繁殖率低、易感病菌[4],還易使金銀花生長不良,藥用有效成分積累減少,造成產(chǎn)品品質(zhì)的下降。加之,野生金銀花繁殖速度慢,而從野外大量取材又易對生物資源及生態(tài)環(huán)境造成破壞,因此不易大量獲得栽培種苗。組培快繁不僅能夠保持親本的優(yōu)良性狀,還具有較高的繁殖系數(shù),并能夠排除外界環(huán)境的干擾進(jìn)行周年生產(chǎn)。當(dāng)前,國內(nèi)外雖有金銀花組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道,如山東平邑縣的紅河金銀花和沂蒙山區(qū)特有的鳳爪金銀花其地域性較強(qiáng),品種上也存在差異[5-6]。另外,前人關(guān)于金銀花組培的研究,在外植體選材上多以莖尖、葉片、芽進(jìn)行組織培養(yǎng),而本試驗(yàn)選取的是植株莖段作外植體,這與前人在取材上存在不同。同時(shí),本試驗(yàn)外植體選取的是當(dāng)年生枝條,有研究報(bào)道選擇2年生枝條做供試材料,在選材上雖然均是植株枝條,但是生長年齡存在不同。在滅菌消毒、不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)等方面所采用的方法與前人亦存在不同,其目的是探索新的組培快繁途徑,為金銀花的快速繁育提供新技術(shù)。總之,本試驗(yàn)通過組織培養(yǎng)的方式研究不同激素組合及濃度配比對野生金銀花莖段滅菌消毒、不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖和生根誘導(dǎo)的影響,以期在保持親本特性的基礎(chǔ)上提高繁殖速度和繁殖系數(shù),實(shí)現(xiàn)金銀花工廠化育苗,促進(jìn)金銀花產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料取自連云港師范高等?？茖W(xué)校試驗(yàn)基地,試驗(yàn)以野生金銀花當(dāng)年生莖段為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

2017年4月10日上午,在大田取金銀花當(dāng)年生健壯幼嫩枝條,剪去葉片,浸泡于含少量洗衣粉的溶液中10min,流水下沖洗20min,用無菌濾紙吸干表面水分,剪成1.5-2.0cm長的帶對生腋芽的幼嫩莖段備用。

1.2.2 外植體滅菌消毒方法試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理,每處理10瓶,每瓶接種5個(gè)外植體,每處理重復(fù)3次,接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。14d后查看并記錄污染數(shù)、死亡數(shù)和無菌苗數(shù)。

接種所用培養(yǎng)基為:MS+6-BA 0.4mg/L+NAA 1.6mg/L+2,4-D 0.2mg/L,pH5.8-6.0。75%堿化乙醇配制方法為:100份體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇+1份質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%的NaOH溶液。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)處理,每處理10瓶,每瓶接種5個(gè)外植體莖段,每處理重復(fù)3次,接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。15d后查看并記錄出芽外植體數(shù)。

1.2.4 增殖培養(yǎng)試驗(yàn)

將長勢基本一致的不定芽從基部切下,接種于添加不同激素和濃度組合的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng),試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)6-BA、NAA組合,每處理接種30瓶,每瓶接種3個(gè)芽,10瓶為1個(gè)重復(fù),每處理3次重復(fù),接種完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。接種所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。28d后觀察記錄不同激素組合及濃度配比對不定芽繼代增殖的影響,記錄增殖數(shù)并計(jì)算增殖系數(shù)。

1.2.5 生根誘導(dǎo)試驗(yàn)

將長勢基本一致、高約2cm的叢生芽從基部切下,轉(zhuǎn)接于添加不同激素和濃度組合的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)IBA、NAA組合,每處理接種30瓶,每瓶接種3個(gè)幼苗,10瓶為1個(gè)重復(fù),每處理3次重復(fù),轉(zhuǎn)接完成后統(tǒng)一放置在人工智能氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接所用培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基,pH5.8-6.0。30d后觀察記錄不同激素組合及濃度配比對金銀花無菌苗生根狀況的影響,記錄生根苗數(shù)、計(jì)算生根率、測定根長。

以上4個(gè)試驗(yàn)的培養(yǎng)條件為,溫度24-26℃,濕度60%-65%,光強(qiáng)2 000Lx,光照時(shí)間12h/d。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 7.02統(tǒng)計(jì)軟件和Microsoft excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

污染率 (%)=染菌的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100;死亡率 (%)=死亡的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100;無菌苗率 (%)=無菌出苗的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100。增殖數(shù)=組培瓶內(nèi)有效苗數(shù);增殖系數(shù)=增殖數(shù)/接種苗數(shù)。生根苗數(shù)=單個(gè)重復(fù)生根苗數(shù);生根率=單個(gè)重復(fù)生根苗數(shù)/單個(gè)重復(fù)轉(zhuǎn)接苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒滅菌方法對外植體污染率、死亡率及無菌苗率的影響

由表1可知,不同消毒方法對金銀花外植體污染率、死亡率及無菌苗率的影響存在差異。A1、A2、A3處理在75%無水乙醇消毒30s條件下,隨0.1%升汞處理時(shí)間的增加,金銀花外植體污染率表現(xiàn)出下降趨勢,死亡率表現(xiàn)出上升趨勢,而無菌苗率表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢,表明升汞處理時(shí)間增加雖能降低外植體污染率,但卻增加了其死亡率,所以并非0.1%升汞消毒時(shí)間越久越好;A4、A5、A6處理在75%堿化乙醇消毒30s條件下,隨0.1%升汞處理時(shí)間的增加,金銀花外植體污染率、死亡率和無菌苗率表現(xiàn)出與前者類似的規(guī)律,但在0.1%升汞處理時(shí)間相同時(shí),使用75%堿化乙醇消毒的處理其污染率和死亡率均對應(yīng)低于用75%乙醇消毒的處理,如A4處理的污染率和死亡率對應(yīng)低于A1處理。另外,A2、A5處理在外植體無菌苗率上差異達(dá)顯著水平 (P＜0.05),而它們與其他處理間差異均達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01),無菌苗率極顯著高于其他處理,分別為76.67%和82.67%,說明這兩個(gè)處理下外植體消毒效果較好,但無菌苗率以A5處理下最高。綜合考慮,外植體最佳消毒滅菌方法為75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min。

表1 不同消毒滅菌方法對外植體污染率、死亡率及無菌苗率的影響Tab.1 Effects of different disinfection and sterilization methods on explant contamination rate,mortality rate and aseptic seedling rate

2.2 不同6-BA和NAA濃度及配比對金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知,在NAA濃度一定時(shí),6-BA對不定芽誘導(dǎo)表現(xiàn)出低濃度促進(jìn),高濃度抑制;而6-BA濃度一定時(shí) (NAA 0.6mg/L除外),NAA對不定芽誘導(dǎo)的影響也表現(xiàn)出類似規(guī)律。

表2 不同6-BA和NAA濃度及配比對金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)的影響Tab.2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on the induction of adventitious buds in explants of Lonicera japonica Thunb.

由表2可知,6-BA濃度0.5mg/L的 B1、B4和B7處理下,不定芽發(fā)生個(gè)數(shù)最少,且生長都相對細(xì)弱。6-BA濃度2.5mg/L的B3、B6和B9處理下,不定芽發(fā)生數(shù)為2-4個(gè),但不定芽較矮且生長慢。6-BA濃度1.5mg/L的 B2、B5和 B8處理下,不定芽發(fā)生個(gè)數(shù)3-6個(gè),不定芽生長快。另外,在6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的B5處理下,出芽外植體數(shù)量和不定芽誘導(dǎo)率分別為44.33和88.67%,與其他處理達(dá)到極顯著差異水平 (P＜0.01),不定芽發(fā)生數(shù)最多,達(dá)到4-5個(gè),且生長健壯、生長速度快。因此,金銀花外植體不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L。

2.3 不同激素組合及濃度配比對金銀花不定芽繼代增殖的影響

由表3可知,不同激素組合及濃度配比對金銀花不定芽繼代增殖的影響差異顯著。其中,含有6-BA的C1和C2處理增殖數(shù)和增殖系數(shù)較大,與其他處理間的差異均達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01),其次是含有ZT的C5和C6處理,而含有KT的C3和C4處理較小,由此可知,6-BA較ZT和KT更有利于金銀花不定芽的繼代增殖,增殖效果最佳。在6-BA、KT或ZT相同而NAA濃度不同條件下,NAA濃度0.02mg/L較0.08mg/L更有利于增殖數(shù)和增殖系數(shù)的增加、不定芽的生長、增粗和分化,如C1處理較C2處理生長快、分化好,C1不定芽增高約3.8cm,高于C2的1.4cm,C3與C4、C5與C6表現(xiàn)出類似的規(guī)律,這說明NAA濃度并非越高越好,超過一定的限度反而不利于金銀花不定芽的生長并使其分化減緩?？傊?C1處理下增殖數(shù)和增殖系數(shù)均最大,分別為123.33和4.11,且接種的不定芽生長快、分化好,所以金銀花繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為C1處理下的配方,即MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L。

表3 不同激素組合及濃度配比對金銀花不定芽繼代增殖的影響Tab.3 Effects of different hormone combinations and concentration ratios on subculture of adventitious buds of Lonicera japonica Thunb.

2.4 不同濃度激素配比對金銀花無菌苗生根誘導(dǎo)的影響

接種7-10d,不同處理的植株陸續(xù)有不定根分化,16-20d各處理不定根逐漸發(fā)生。由表4可以看出,在金銀花無菌苗接種30d后,各處理均有不定根長出,但處理間生根苗數(shù)、出苗率、根長和根系生長狀況存在差異。在IBA濃度1.5-3.5mg/L范圍內(nèi),金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長表現(xiàn)出類似的規(guī)律,均隨其濃度的增加呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢,并以IBA濃度2.5mg/L時(shí)上述指標(biāo)最佳。

表4 不同濃度激素配比對金銀花無菌苗生根誘導(dǎo)的影響Tab.4 Effects of different concentrations of hormones on rooting induction of aseptic seedling of Lonicera japonica Thunb.

由表4可知,在IBA濃度相同時(shí),金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長的表現(xiàn)在NAA濃度0.6mg/L時(shí)好于 0.2mg/L時(shí)。D5(IBA 2.5mg/L+NAA 0.6mg/L)處理下,金銀花生根苗數(shù)、出苗率、根長分別為 27.67個(gè)、92.2%和 3.27cm,與 D1、D3、D4差異水平達(dá)到極顯著 (P＜0.01),與D2、D6差異不明顯;生長狀況,以D1、D4處理生根慢,D3、D6處理雖然生根快,但根系細(xì)弱且有愈傷組織出現(xiàn),D2和D5處理根系生長快且根系健壯。所以,金銀花無菌苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好。

3 結(jié)論與討論

以野生金銀花當(dāng)年生莖段為外植體,MS和1/2 MS作基本培養(yǎng)基,研究不同激素對金銀花外植體滅菌消毒效果、不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)和組培苗生根誘導(dǎo)的影響,以建立野生金銀花高效快繁體系。結(jié)果表明:外植體最佳消毒滅菌方法為75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min,外植體無菌苗率達(dá)到82.67%;不定芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L,不定芽誘導(dǎo)率為88.67%;繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.02mg/L,增殖倍數(shù)達(dá)到4.11,與其他處理差異達(dá)到極顯著水平 (P＜0.01);生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好,生根率和根長分別達(dá)到85.56%-92.22%和3.14-3.27cm。

金銀花外植體無菌材料的獲得是其進(jìn)行組培快繁的前提條件,但由于其枝條表面生有疏腺毛和疏柔毛,內(nèi)部中空[7],常規(guī)消毒方法難以有效殺滅病菌。本試驗(yàn)條件下,0.1%升汞處理12min對當(dāng)年生莖段的滅菌效果好且無菌苗率最高,而處理時(shí)間5min和19min效果均不理想。李翔等[8]在對華南忍冬 (Lonicera confusa)組織培養(yǎng)的無菌研究時(shí)指出,金銀花腋芽用75%酒精處理25s+0.1%升汞處理9min和帶腋芽的莖段用75%酒精處理30s均能取得較好的滅菌效果,與本試驗(yàn)條件下升汞處理時(shí)間不同,這可能是因?yàn)槠贩N的不同、處理時(shí)間的長短等對試驗(yàn)結(jié)果的影響存在差異。本研究還得出,在0.1%升汞處理時(shí)間相同前提下,75%堿化乙醇對金銀花外植體表明滅菌效果優(yōu)于75%乙醇,這可能是因?yàn)閴A化乙醇中所含的OH-能改變細(xì)胞表面所帶電荷的性質(zhì),進(jìn)而改變膜的通透性[9],使其殺菌效果較75%乙醇更為理想?？傊?本試驗(yàn)研究表明,當(dāng)年生莖段作外植體,采用75%堿化乙醇+0.1%升汞消毒12min進(jìn)行消毒,可使用外植體無菌苗率達(dá)到82.67%,效果較好。

6-BA有利于芽的分化并能促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長[10],NAA在低濃度下能夠促進(jìn)細(xì)胞生長,而高濃度下促使細(xì)胞成熟衰老[11]。楊冬業(yè)等[12]通過在培養(yǎng)基中添加6-BA和IBA兩種激素進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)研究,指出以 MS作基本培養(yǎng)基,添加6-BA 2.0mg/L+IBA0.01-0.05mg/L適合不定芽的誘導(dǎo)。本試驗(yàn)條件下,以金銀花莖段作外植體,采用MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.12mg/L的方法使不定芽誘導(dǎo)效果最佳。6-BA濃度過低、過高均不利于金銀花不定芽的發(fā)生,NAA在低濃度下能夠促進(jìn)芽的生長,而在高濃度下作用與之相反,可見只有生長素和細(xì)胞分裂素在一定濃度時(shí)才能較好地誘導(dǎo)金銀花不定芽的發(fā)生。

IBA是試管苗生根試驗(yàn)中最為常用的生根劑之一[11],其濃度過低過高均不利于組培苗生根,當(dāng)濃度過低時(shí)對組培苗生根誘導(dǎo)的促進(jìn)作用不明顯,過高時(shí)會誘導(dǎo)出大量的愈傷組織從而降低生根率[13],因此只有適宜濃度的IBA才有利于試管苗的生根。本試驗(yàn)條件下,金銀花無菌苗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方以1/2MS+IBA 2.5mg/L+NAA 0.2-0.6mg/L較好,而當(dāng)IBA濃度達(dá)到3.5mg/L時(shí)D3和D6兩個(gè)處理組培苗均出現(xiàn)了愈傷組織,而愈傷組織的出現(xiàn)將嚴(yán)重影響金銀花室外移栽成活率[14],因此D6處理下的培養(yǎng)基配方不適于生根誘導(dǎo)。趙賢惠[15]在以紅金銀花頂芽為外植體進(jìn)行組培快繁研究時(shí)指出,生根培養(yǎng)以1/2MS+6-BA 0.25mg/L+NAA 1.0mg/L+活性炭1.0g/L可得到理想的生根苗。李永興等[16]研究認(rèn)為,以 1/2MS+NAA 1.50mg/L作培養(yǎng)基,金銀花灰氈毛忍冬組培苗生根效果最好,前人研究結(jié)論與本試驗(yàn)結(jié)果不一致,這可能是因?yàn)檠芯克玫钠贩N及組培所用植株部位不同造成試驗(yàn)結(jié)果的差異。