徐秀紅，呂桂華，郭國(guó)錦，陳堅(jiān)劍

(1.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.浙江省東陽(yáng)玉米研究所，浙江 東陽(yáng) 322100)

植酸，又稱(chēng)肌醇六磷酸，是自然界作物種子中含磷最豐富的化合物，占種子總磷含量的65%～85%和酸溶性肌醇磷酸鹽的90%以上[1]，是玉米籽粒中廣泛存在的一種有機(jī)酸(肌醇六磷酸)。植酸被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它易與玉米種子中微量金屬元素螯合成植酸鹽，人和非反芻動(dòng)物(缺乏植酸酶)難以消化吸收利用這些植酸鹽，從而降低了Zn2+、Fe3+、Ca2+等微量金屬元素的生物有效性[2]。而不可利用的植酸鹽被排泄到環(huán)境中，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，特別是水體富營(yíng)養(yǎng)化。因此，解決和改善這些問(wèn)題迫在眉睫，而降低玉米種子的植酸含量是有效途徑之一[3]。

理化誘變技術(shù)是降低玉米種子植酸含量有效可行的途徑，通過(guò)該技術(shù)研究人員在水稻、大麥、小麥、大豆、玉米等作物上獲得了大量的低植酸突變體，植酸含量下降的程度在30%-93%，同時(shí)還伴隨著無(wú)機(jī)磷含量的顯著增加[4]。玉米低植酸突變體最早是由Raboy等[5]采用化學(xué)誘變劑EMS對(duì)玉米花粉進(jìn)行誘變獲得的，其育成了兩份低植酸含量的玉米突變體lpa1-1和lpa2-1。國(guó)內(nèi)的低植酸玉米研究起步較晚，一些玉米突變體陸續(xù)被篩選出，但對(duì)突變體及野生型親本的生化特性和農(nóng)藝性狀研究鮮有報(bào)道。本研究主要采用60Coγ射線(xiàn)對(duì)玉米自交系種子進(jìn)行輻射誘變，經(jīng)過(guò)幾代的選擇、鑒定獲得了2份低植酸突變體，并開(kāi)展了突變體的遺傳控制類(lèi)型、生化特性和農(nóng)藝性狀等初步研究工作，以期為低植酸玉米新品種選育奠定堅(jiān)實(shí)的材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 玉米低植酸突變體材料的選育

于2014年選取玉米自交系Zhong為材料，均種植于浙江省東陽(yáng)玉米研究所試驗(yàn)田內(nèi)。利用60Coγ射線(xiàn)對(duì)玉米的種子進(jìn)行輻射誘變，處理劑量為250 Gy，處理地點(diǎn)為浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)利用研究所的輻照中心。M0種子(輻照后)按單株種植，套袋自交獲得種子混收；M1植株自交所結(jié)種子(記為M1∶2，以下類(lèi)推)混收，M2按單株種植，自交后所得種子M2∶3則按單株收獲。每株取8粒M2∶3種子，按Xu等[6]方法檢測(cè)無(wú)機(jī)磷含量，選取顯色為高無(wú)機(jī)磷(high inorganic phosphorus, HIP)突變種子，將該單株剩余的種子種成株行，成熟后單株收獲種子，繼續(xù)檢測(cè)HIP籽粒的分離情況，直至獲得純合HIP突變株系。

1.2 高無(wú)機(jī)磷(HIP)種子檢測(cè)

以L(fǎng)arson等[7]的方法為基礎(chǔ)進(jìn)行改進(jìn)。從收獲的玉米種子中，每份種子選取16粒成熟飽滿(mǎn)的，用剪刀從種子中間剪半或1/3，置于96孔深孔板中，然后按每毫克樣品質(zhì)量10 μL加入提取液0.4 mol·L-1HCl，一般為200 μL，用板蓋蓋緊，4 ℃條件下放置過(guò)夜。次日，從深孔板中用8管排槍吸取10 μL浸提液于96孔酶標(biāo)板中，加入90 μL蒸餾水；在酶標(biāo)板上設(shè)置5個(gè)用KH2PO3配制的標(biāo)準(zhǔn)P溶液，含P量分別為0 μg·mg-1(Ⅰ)、0.155 μg·mg-1(Ⅱ)、0.465 μg·mg-1(Ⅲ)、0.93 μg·mg-1(Ⅳ)和1.395 μg·mg-1(Ⅴ)，溶液體積為100 μL。

在樣品浸提液和標(biāo)準(zhǔn)P溶液中加100 μL顯色劑，室溫下靜置0.5～1.0 h顯色。其中，顯色劑由3 mol·L-1H2SO4、2.5%鉬酸銨、10%抗壞血酸(貯于4 ℃)和蒸餾水按體積比1∶1∶1∶2配制而成，加入順序?yàn)檎麴s水、3 mol·L-1H2SO4、2.5%鉬酸銨、10%抗壞血酸，現(xiàn)用現(xiàn)配。標(biāo)準(zhǔn)P溶液顯色后分別呈淺黃色/無(wú)色、微藍(lán)色、淺藍(lán)色、藍(lán)色和深藍(lán)色。顯色在標(biāo)準(zhǔn)P溶液(Ⅲ)以上(含P量>0.465 μg·mg-1)的種子樣本，可判定為高無(wú)機(jī)磷(HIP)種子，用于下一步的研究與分析。每份材料測(cè)16粒種子，檢測(cè)材料是否純合。

1.3 突變的等位性測(cè)驗(yàn)及遺傳控制類(lèi)型材料準(zhǔn)備

1.3.1 等位性測(cè)驗(yàn)

2016年秋，對(duì)種植的高無(wú)機(jī)磷突變體lpa-zhong1和lpa-zhong2進(jìn)行互交，對(duì)收獲的F1種子進(jìn)行無(wú)機(jī)磷(HIP)含量檢測(cè)，判斷其等位性。

1.3.2 遺傳控制類(lèi)型研究材料

2016年秋，配制了以下雜交組合鄭58×lpa-zhong1、鄭58×lpa-zhong2、昌7-2 ×lpa-zhong1和昌7-2×lpa-zhong2。分離群體為F1植株自交產(chǎn)生的后代F2∶3的遺傳群體。對(duì)F1和F2種子進(jìn)行無(wú)機(jī)磷含量檢測(cè)，判斷其顯色類(lèi)型。

1.4 種子發(fā)芽率的測(cè)定

選取收獲的親本自交系Zhong和兩個(gè)低植酸突變體lpa-zhong1、lpa-zhong2發(fā)育良好、形態(tài)完整自然風(fēng)干的種子50粒，采用沙床法進(jìn)行種子發(fā)芽率的測(cè)定，加入適量的水，置于25 ℃的人工智能培養(yǎng)箱中，3次重復(fù)，記錄種子萌發(fā)后種子的發(fā)芽粒數(shù)，以百分率計(jì)算；田間成苗率則是選取各材料飽滿(mǎn)完整自然風(fēng)干的種子50粒，于田間覆土萌發(fā)，記載在田間試驗(yàn)條件下存活的植株數(shù)。

1.5 各磷組分含量和微量金屬元素含量的定量分析

1.5.1 總磷(TP)和金屬元素含量的測(cè)定

樣品處理：取100 g成熟自然風(fēng)干的親本Zhong和lpa-zhong1、lpa-zhong2的種子，去雜選凈后，放置于真空干燥箱中60 ℃真空干燥72 h，后經(jīng)旋風(fēng)粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目網(wǎng)篩，用自封袋裝好后置于干燥器中，低溫干燥保存。用于測(cè)定總磷、無(wú)機(jī)磷、植酸磷和金屬元素含量。

總磷含量的測(cè)定：種子總磷含量的測(cè)定參考Hansen等[8]的方法。每個(gè)樣品取約100 mg加入到微波消解管中，然后每管加入6 mL 65% HNO3和0.2 mL H2O2。采用Microwave3000(Anton PAAR，Graz，Austria)微波消解系統(tǒng)進(jìn)行樣品消化；消解結(jié)束后將微波消煮管蓋打開(kāi)，置于趕酸器中160 ℃排酸后加去離子水定容至20 mL。消化后的樣品采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES) (Optima 8000DV，PerkinElmer，USA)測(cè)定磷含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

金屬元素含量測(cè)定：種子金屬元素提取同樣采用微波消解消煮法，但每個(gè)樣品增加至約500 mg；元素含量的測(cè)定采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES) (Optima 8000DV，PerkinElmer，USA)。

1.5.2 無(wú)機(jī)磷(Pi)含量的測(cè)定

P標(biāo)準(zhǔn)液的制備和工作曲線(xiàn)的繪制：將KH2PO3用錫箔紙包好，置于烘箱中105 ℃干燥1 h，放置于干燥器中冷卻。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.219 5 g溶解于水，移入1 L容量瓶中，加硝酸3 mL，用蒸餾水定容，上下顛倒混勻，制備成50 μg·mL-1的P標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確量取0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mL P標(biāo)準(zhǔn)液放入50 mL容量瓶，各加10 mL釩鉬酸銨顯色劑(含100 g·L-1鉬酸銨，2.35 g·L-1釩酸銨和165 mL·L-165%硝酸)，用蒸餾水稀釋定容搖勻，常溫下靜置10 min，以0 mL溶液為對(duì)照，在400 nm下用島津UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定各種P標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值，以P含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(xiàn)，得到P含量與D值的線(xiàn)性方程。

無(wú)機(jī)磷(Pi)含量測(cè)定。根據(jù)Wilcox等[9]所用的無(wú)機(jī)磷測(cè)定方法加以改進(jìn)，取親本和突變體樣品各0.5 g，兩次重復(fù)，放入50 mL離心管中，加入10 mL提取液(12.5% TCA+25 mmol·L-1MgCl2)，置于恒溫振蕩器中，4 ℃條件下振蕩過(guò)夜。將樣品放于低溫超速離心機(jī)中，4 ℃條件下10 000 r·min-1離心15 min，提取上清液5 mL，按釩鉬酸銨顯色法根據(jù)工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程測(cè)定Pi的含量。

1.5.3 植酸磷(PA-P)的測(cè)定

植酸磷含量的測(cè)定方法參考Tan等[10]報(bào)道的高效離子色譜法(HPIC)。稱(chēng)取約300 mg玉米粉到50 mL離心管中，加入10 mL 0.6 mol·L-1HCl，混勻后置于沸水浴中孵育30 min；將樣品取出冷卻至室溫后，10 000g4 ℃離心15 min，取450 μL上清液用去離子水稀釋10倍至4.5 mL；將稀釋后的樣品依次經(jīng)過(guò)IC-RP柱、IC-H柱、0.22 μm微孔濾膜以去除樣品中的疏水性物質(zhì)、堿土金屬離子、碳酸根離子、過(guò)渡金屬離子、大分子物質(zhì)等。

制備好的樣品通過(guò)離子交換色譜儀ICS-2000 (Dionex， Sunnyvale， CA， USA)檢測(cè)，其中分離柱為IonPac AS11-HC (250 mm×4 mm)、保護(hù)柱為IonPac AG11-HC (50 mm×4 mm)，淋洗液采用50 mmol·L-1KOH，淋洗速率為1 mL·min-1。通過(guò)電導(dǎo)檢測(cè)儀在124 mA抑制電流下檢測(cè)信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)樣品采用植酸鈉(P-3168， Sigma， St. Louis， MO， USA)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體的獲得、等位性測(cè)驗(yàn)和突變的遺傳控制類(lèi)型

通過(guò)對(duì)玉米自交系Zhong進(jìn)行輻照處理，經(jīng)過(guò)M0、M1多代自交混收，獲得M1∶2植株即M2群體，單穗收獲的M2∶3種子，按單株進(jìn)行高無(wú)機(jī)磷(HIP)玉米籽粒的檢測(cè)。在1 860株系M2∶3種子中，檢測(cè)到HIP突變體2份，其籽粒無(wú)機(jī)磷含量高于標(biāo)準(zhǔn)P的Ⅳ(0.93 μg·mg-1)，并經(jīng)后代種植鑒定檢測(cè)，低植酸性狀穩(wěn)定不再分離，是穩(wěn)定遺傳的(圖1)。自M5起，這兩個(gè)突變體分別定名為lpa-zhong1和lpa-zhong2。

對(duì)高無(wú)機(jī)磷突變體lpa-zhong1和lpa-zhong2互交的F1種子進(jìn)行無(wú)機(jī)磷檢測(cè)，結(jié)果表明，其與突變體顯色一致，說(shuō)明這兩個(gè)突變是等位的。

對(duì)組合鄭58×lpa-zhong1、鄭58×lpa-zhong2、昌7-2×lpa-zhong1和昌7-2×lpa-zhong2的F1種子進(jìn)行HIP籽粒檢測(cè)，結(jié)果表明，顯色與野生型親本相似，基本無(wú)色，可確定lpa突變是由隱性基因所控制。對(duì)鄭58×lpa-zhong1 F2群體252個(gè)單株所結(jié)的F2∶3種子進(jìn)行HIP籽粒檢測(cè)，結(jié)果有183個(gè)單株表現(xiàn)為低Pi，69個(gè)單株表現(xiàn)為HIP，經(jīng)卡方檢測(cè)，其分離比例符合3∶1理論比，表明lpa-zhong1為單隱性基因控制類(lèi)型，因lpa-zhong2與lpa-zhong1等位，即lpa-zhong2也為單隱性基因控制類(lèi)型。

1A-1E和12D-12H，不同濃度的P標(biāo)樣(0、0.155、0.465、0.930、1.395 μg·mg-1)；1F-1H和12A-12C，野生型親本；2A-2H、3A-3H、4A-4H、5A-5H、6A-6H、7A-7H、8A-8H、9A-9H、10A-10H、11A-11H：不同單株的高無(wú)機(jī)磷突變體。Both 1A to 1E and 12D to 12H are P standards at amounts of 0， 0.155， 0.465， 0.930， 1.395μg·mg-1，respectively; 1F to 1H and 12A to 12C， wild type parent lines; 2A to 2H，3A to 3H，4A to 4H，5A to 5H，6A to 6H，7A to 7H，8A to 8H，9A to 9H，10A to 10H and 11A to 11H are homozygous for LPA.圖1 高無(wú)機(jī)磷突變體與野生型親本的種子無(wú)機(jī)磷檢測(cè)Fig.1 Detection of high levels of inorganic P by molybdenum staining of hydrochloric extracts of maize grains

2.2 突變體與野生型親本的發(fā)芽率

對(duì)不同收獲季節(jié)的突變體與野生型親本的發(fā)芽率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，突變體的發(fā)芽率極顯著下降，田間成苗率則無(wú)顯著變化。這一結(jié)果說(shuō)明，兩個(gè)突變均為非致死型突變，但卻造成了發(fā)芽率極顯著下降，而突變體的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有受到顯著影響(表1)。這與Raboy等[11]、Pilu等[12]報(bào)道的玉米高無(wú)機(jī)磷突變體情況類(lèi)似。

2.3 突變體與野生型親本的磷組分含量變化

從表2的結(jié)果可以得出，與對(duì)照相比，兩個(gè)突變體的無(wú)機(jī)磷含量和植酸磷含量都極顯著增加，lpa-zhong1和lpa-zhong2無(wú)機(jī)磷含量分別是野生型親本的4.7和2.8倍，植酸磷含量分別下降了40%和21%；總磷含量也一樣，突變體的總磷含量都極顯著高于親本野生型。據(jù)報(bào)道，與野生型親本對(duì)照相比，低植酸高無(wú)機(jī)磷突變體多數(shù)的總磷含量基本不變，但也有例外，少數(shù)低植酸突變體的總磷含量高于或低于野生型親本，如Hatzack等[13]發(fā)現(xiàn)的大麥A型低植酸突變體，其種子總磷含量則高于野生型種子，這與我們的研究結(jié)果類(lèi)似。

表1 不同種植時(shí)間的突變體與野生型親本的發(fā)芽率及成苗率測(cè)定Table 1 Germination rate and field emergence rate of LPA mutant lines and wild type parent lines in different planting time

**表示突變體與野生型親本的指標(biāo)在0.01水平下差異極顯著。下同。
The asterisks ** indicate that the mean value of mutants was significantly different from that of WT atP<0.01 level. The same as below.

表2 高無(wú)機(jī)磷突變體與野生型親本的總磷、無(wú)機(jī)磷和植酸磷含量Table 2 The concentrations of various forms of P in LPA mutant lines and wild type parent lines

2.4 突變體與野生型親本的微量金屬元素含量

本研究表明，突變體與野生型親本的微量元素含量變化無(wú)明顯規(guī)律(表3)。突變體lpa-zhong2的Fe元素含量顯著高于野生型，而突變體lpa-zhong1則與野生型相當(dāng)；兩個(gè)突變體的Zn元素含量都顯著低于野生型；突變體lpa-zhong2的Na元素含量與野生型相當(dāng)，而突變體lpa-zhong1則顯著高于野生型親本；兩個(gè)突變體Mn、K、Ca、Mg和S元素的含量都顯著低于野生型親本。

2.5 突變體的產(chǎn)量性狀和農(nóng)藝性狀

通過(guò)浙江東陽(yáng)的3季種植，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)氣候環(huán)境的改變對(duì)種子的HIP表型影響較小。親本與突變體的產(chǎn)量性狀和農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)結(jié)果表明，與野生型親本相比，除了百粒重略有降低之外，其他產(chǎn)量性狀和農(nóng)藝性狀無(wú)顯著變化(表4、表5)。

表3 突變體與野生型親本的微量金屬元素含量Table 3 Trace element contents of LPA mutant lines and wild type parent lines

同列不同行數(shù)據(jù)后沒(méi)有相同小寫(xiě)字母表示0.05水平下差異顯著。
For the mean values of the mutant lines and wild type parent lines， multiple comparisons were undertaken and the different letters indicate the significant difference atP<0.05.

表4 不同種植時(shí)間的突變體與野生型親本的產(chǎn)量性狀Table 4 Yield and yield-related agronomic traits of LPA mutants and wild type parent lines in different planting time

表5 不同種植時(shí)間的突變體與野生型親本的農(nóng)藝性狀Table 5 The agronomic traits of LPA mutants and wild type parent lines in different planting time

3 討論

迄今為止，在水稻[6，10，14]、玉米[15-18]、大豆[19]和大麥[13，20]等主要農(nóng)作物中均已獲得了低植酸、高無(wú)機(jī)磷(HIP)的突變種質(zhì)。玉米中現(xiàn)主要有l(wèi)pa1、lpa2和lpa3三種突變被鑒定出來(lái)。其中，Raboy等[2]通過(guò)NaN3化學(xué)誘變劑獲得的lpa1-1玉米突變系歸類(lèi)為lpa1突變，其種子植酸含量降低，伴隨著無(wú)機(jī)磷的升高，未積累肌醇和低價(jià)肌醇磷酸鹽中間物，總P量保持不變；Shi等[15]和Badone等[16]獲得的玉米突變系lpa1和lpa1-7均屬于此類(lèi)突變；Raboy等[11]、Pilu等[12]和Shi等[17]獲得的lpa2-1、Lpa241和lpa2突變則不同，歸類(lèi)為lpa2突變，主要表現(xiàn)在種子植酸含量下降、無(wú)機(jī)磷含量升高的同時(shí)，低價(jià)肌醇磷酸鹽含量上升，而總P量仍然保持不變；lpa3突變則表現(xiàn)出種子植酸含量減少，無(wú)機(jī)磷含量和肌醇含量顯著增加，但低價(jià)肌醇磷酸鹽沒(méi)有明顯變化[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，低植酸、高無(wú)機(jī)磷的玉米突變體大多數(shù)是通過(guò)化學(xué)誘變培育而成，而通過(guò)輻照誘變創(chuàng)造出的HIP材料則較少。本實(shí)驗(yàn)采用這一方法獲得高HIP突變體。這兩個(gè)突變等位，屬于單隱性基因控制類(lèi)型，這與前人報(bào)道的研究結(jié)果一致。突變體的總P含量都極顯著高于野生型親本，這與多數(shù)突變體報(bào)道的結(jié)果不同，僅與Hatzack等[13]研究的大麥A型低植酸突變體的結(jié)果類(lèi)似。

前人研究表明，在玉米HIP突變體的研究中，絕大多數(shù)伴隨著植酸含量的下降、無(wú)機(jī)磷含量的升高，農(nóng)藝性狀和種子品質(zhì)特性也會(huì)出現(xiàn)不同程度的變化，主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽率下降，粒重下降等[11]。通過(guò)對(duì)兩個(gè)突變體的初步研究發(fā)現(xiàn)，突變?cè)斐闪税l(fā)芽率和百粒重下降，但產(chǎn)量性狀和農(nóng)藝性狀無(wú)顯著變化，這可能會(huì)影響突變體的后續(xù)利用，這也與前人的報(bào)道基本一致。這些變化是由突變的直接作用還是間接作用引起，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

此外，突變體種子質(zhì)量變劣可通過(guò)育種途徑進(jìn)行改善，如采用多次回交和常規(guī)品種雜交等方法改良突變體的產(chǎn)量性狀，這已在玉米和大豆低植酸突變體中取得了進(jìn)展[10]。這說(shuō)明，低植酸高無(wú)機(jī)磷玉米突變體具備一定應(yīng)用價(jià)值，可作為低植酸高無(wú)機(jī)磷玉米雜交種的基礎(chǔ)材料，而低植酸商業(yè)雜交種的育成將對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)元素吸收利用發(fā)揮重要作用。