張 雪，宋春蓮，謝相悅，吳常月，劉永波，李 鑫，舒相華

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201)

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus2，PCV2)引起的一種以體質(zhì)下降、消瘦、貧血、黃疸及內(nèi)臟器官、皮膚的廣泛病理變化的綜合征。2001年我國(guó)首次報(bào)道后，該病在我國(guó)的流行呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]。PCV2致病性較強(qiáng)，引起仔豬多種疾病，主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、皮炎和腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、增生性壞死性間質(zhì)性肺炎和繁殖障礙[1]。豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一種以發(fā)熱和腦脊髓炎為特征的急性傳染病[1]。主要危害新生仔豬的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)，導(dǎo)致母豬繁殖障礙。我國(guó)豬群普遍存在PRV野毒感染，并呈散發(fā)性流行。近年來(lái)豬場(chǎng)PRV感染率逐年上升，嚴(yán)重制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展[3-4]。PVC2和PRV二者混合感染可導(dǎo)致免疫抑制，使病情復(fù)雜化，增加了發(fā)病率，導(dǎo)致病死率激增，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。PCV2和PRV混合感染的情況在云南地區(qū)部分豬群中比較嚴(yán)重，發(fā)生和流行情況有逐年加重的趨勢(shì)[6]，迫切需要對(duì)二者混合感染進(jìn)行研究和有效預(yù)防。

PCV2和PRV的檢測(cè)方法很多，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)具有準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、敏感性高、快速及高通量等優(yōu)點(diǎn)，并可以對(duì)病原進(jìn)行定量檢測(cè)，是許多實(shí)驗(yàn)室首選的檢測(cè)手段。免疫組化診斷技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確、形態(tài)和功能相結(jié)合以及在抗原定位上的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，因而可以用來(lái)觀察病毒抗原的組織分布和細(xì)胞定位，可更好地理解病毒的致病機(jī)制[7-8]。肝臟是機(jī)體的解毒器官，也是酶合成及代謝的重要器官。當(dāng)肝細(xì)胞損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死,通透性增加或者酶在肝內(nèi)病理性合成亢進(jìn)。腎臟是機(jī)體的排泄器官，可調(diào)節(jié)電解質(zhì)濃度、體內(nèi)水和滲透壓平衡、酸堿平衡以及內(nèi)分泌功能[9]。研究豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病病毒混合感染對(duì)仔豬肝腎損傷有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物及病毒 公豬和母豬自然交配所產(chǎn)的32頭2月齡仔豬，來(lái)自于云南文山山區(qū)，自繁自養(yǎng)，沒(méi)有接種任何疫苗，經(jīng)PCR檢測(cè)PRV、PVC2、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)均為陰性的。PRV和PCV2毒株，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室分離保存，病毒效價(jià)分別為1×106.5TCID50/mL和1×106TCID50/mL。

1.1.2 主要試劑及儀器 蘇木精溶液、伊紅溶液，自己配制；小鼠IgG SABC免疫組化染色試劑盒(批號(hào)：201510)，博士德生物有限公司產(chǎn)品；DEPC(分析純)；DNA提取試劑盒；SYBR○RPrime ExTaqTMⅡ；PMD○R18-T Vector、瓊脂粉、TAE緩沖液、異丙醇、氯仿、750 mL/L乙醇、質(zhì)粒抽提試劑盒。

切片機(jī)，顯微鏡，水浴鍋等，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供；熒光定量PCR儀(CFD-3120)，Bio-Rad公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-7C)，北京六一儀器廠產(chǎn)品；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀移液器(KA0052521)，DRAGON公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(75005440),Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-160000)，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(HWS12)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組及病毒接種 仔豬正常飼喂1周后，分成3個(gè)試驗(yàn)組(各10頭)和對(duì)照組(2頭)，試驗(yàn)Ⅰ組仔豬頸部肌肉注射PRV懸液2 mL；試驗(yàn)Ⅱ組注射PCV2懸液 2 mL，試驗(yàn)Ⅲ組分別在仔豬頸部肌肉兩側(cè)注射PRV 1 mL和PCV2 1 mL(由于兩個(gè)單感染組病毒總量均為2 mL,為使組別病毒總量相等故而將混合感染組中每個(gè)病毒量做了減半處理)。Ⅳ組2頭為對(duì)照組，頸部肌肉注射生理鹽水2 mL。

1.2.2 樣品采集 攻毒后分別在第3、7、14、21、35天前腔靜脈無(wú)菌采血后，隨機(jī)宰殺2頭試驗(yàn)仔豬，對(duì)照組在第35天宰殺，觀察臨床癥狀，病理剖檢，無(wú)菌采集肝、腎組織樣品2份，1份用40 mg/mL的甲醛溶液浸泡備用，另1份用于real-time PCR檢測(cè)。

1.2.3 HE染色 參照HE病理染色技術(shù)操作步驟進(jìn)行的染色[10]。

1.2.4 免疫組化染色 參照鼠IgG SABC免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)國(guó)內(nèi)外發(fā)表的PCV2和PRV毒株序列，用Lasergene.v7.1、Primer Premier 5.0、Oligo6.0等分子生物學(xué)分析軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)PRV和PCV2的引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)SYBR Green Ⅰ qPCR的退火溫度、引物濃度、反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行篩選優(yōu)化，以得到最佳的real-time PCR反應(yīng)條件，具體配置體系如下：PRV總反應(yīng)體系20 μL，其中SYBRⅡ 10 μL,上游引物(F)0.8 μmol/L,下游引物(R)0.8 μmol/L,cDNA 2.0 μL， ddH2O補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件為:95℃ 2 min;95℃ 15 s,59℃ 20 s,65℃ 5 s,共35循環(huán)；PCV2總反應(yīng)體系25 μL，其中包含Mix(含10×PCR buffer、dNTPs、TransTaq酶)12.5 μL,ddH2O 10.5 μL,上游引物(YH-1)0.5 μmol/L,下游引物(YH-2)0.5 μmol/L,模版cDNA1 μL。real-time PCR反應(yīng)程序：94℃ 2 min;94℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 40 s，共35循環(huán)。

1.2.5.3 real-time PCR準(zhǔn)確性分析 與常規(guī)PCR比較，進(jìn)行靈敏性試驗(yàn)；用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)分離或保存的毒株或菌株分別提取藍(lán)耳病毒(PRSSV)、豬瘟病毒(CSFV)、副豬嗜血桿菌(HPS)、偽狂犬病毒(PRV)核酸提?。焕锰崛〉暮怂嶙鳛槟０暹M(jìn)行特異性試驗(yàn)。

PRV進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)指數(shù)PRV(r2)為0.998,回歸方程的擬合度較高，誤差較小；擴(kuò)增效率(E)為103.8%，擴(kuò)增效率在正常的范圍之內(nèi)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得出Ct值與拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系表達(dá)式:Ct=-3.232x+28.027(圖1)。

PCV2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)指數(shù)(r2)為1.000,回歸方程的擬合度很高，誤差很?。粩U(kuò)增效率(E)為92.7%。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得出Ct值與拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系表達(dá)式:Ct=-3.510x+32.996(圖2)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 20軟件和Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀及體溫測(cè)定

3個(gè)感染組仔豬均在接毒12 h后出現(xiàn)體溫升高，兩個(gè)單獨(dú)感染組接種病毒第20天之后趨于正常，混和感染組仔豬在接毒后第10天以后體溫驟然下降，提示預(yù)后不良。感染組仔豬精神沉郁，食欲不振，第7天，臨床癥狀較為明顯, PRV感染組和混合感染組仔豬有共濟(jì)失調(diào)，后肢癱瘓、犬坐式的神經(jīng)癥狀及擦墻的癢癥，在PCV2感染組仔豬腿部和腹部發(fā)現(xiàn)有黑色斑塊；混合感染組第14天以后仔豬不能耐過(guò)有死亡豬只。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.擴(kuò)增曲線

A.Standard curve;B. Amplification curve

圖1 PRV熒光定量PCR

Fig.1 Real-time fluorescent quantitative PCR of PRV

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線;B.擴(kuò)增曲線

A.Standard curve;B. Amplification curve

圖2 PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

Fig.2 Real-time PCR of PCV2

2.2 大體病理變化

對(duì)照組仔豬肝臟腎臟均正常；試驗(yàn)組肝臟大體病理變化如圖3，混合感染組肝臟表面分布的壞死灶多于兩個(gè)單獨(dú)感染組；腎臟大體病理變化如圖4，混合感染組腎臟腫脹、腎盂出血、淤血，腎髓質(zhì)腫脹、出血，髓質(zhì)與皮質(zhì)界限明顯，出血量大于單獨(dú)感染組。

2.3 病理組織學(xué)變化

對(duì)照組仔豬肝臟、腎臟均正常；試驗(yàn)組肝臟和腎臟病理組織學(xué)變化如圖5和圖6，可見(jiàn)PRV感染組肝細(xì)胞間質(zhì)增寬，肝血竇內(nèi)大量紅細(xì)胞滲出；PCV2感染組肝組織匯管區(qū)大量出血，肝小葉邊緣的細(xì)胞核溶解，有水泡樣變性，巨噬細(xì)胞增多；腎小體內(nèi)漿液滲出，遠(yuǎn)曲小管管腔增大，巨噬細(xì)胞增多。腎小體內(nèi)大量出血，巨噬細(xì)胞聚集，近曲小管結(jié)構(gòu)破壞，致密斑處巨噬細(xì)胞增多。混合感染組肝組織淤血較單獨(dú)感染組嚴(yán)重，中央靜脈模糊，紅細(xì)胞破裂，肝血竇寬度擴(kuò)大，肝細(xì)胞索紊亂，巨噬細(xì)胞增多，細(xì)胞核溶解消失(圖5)；腎小體內(nèi)出血嚴(yán)重，遠(yuǎn)曲小管周?chē)罅砍鲅?圖6)。

2.4 SABC染色結(jié)果

2.4.1 PRV陽(yáng)性分布 PRV陽(yáng)性主要分布于肝臟的匯管區(qū)及細(xì)胞間質(zhì)，混合感染PRV陽(yáng)性分布較單獨(dú)感染高。單獨(dú)感染組PRV陽(yáng)性分布于腎小體周?chē)闹旅馨咛?，混合感染組腎小體以及周?chē)芮粌?nèi)均有大量PRV陽(yáng)性分布(圖7)。

2.4.2 PCV2陽(yáng)性分布 肝和腎的陰性對(duì)照分別如圖8A和D。PCV2主要分布于肝小葉邊緣的肝血竇和細(xì)胞漿，以及腎臟的腎小體內(nèi)和周?chē)慕」?，混合感染組的陽(yáng)性分布于管腔上皮細(xì)胞且面積大于單獨(dú)感染組。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

從圖9可知PRV單獨(dú)感染組的肝臟病毒載量先升高后降低,在第3天達(dá)到峰值,為412.52拷貝/μL，與第0、14、21、35天比較，差異顯著(P<0.05)?；旌细腥窘M肝臟病毒載量先升高再降低，然后再升高再降低。混合感染組肝臟病毒載量在第14天達(dá)到峰值，為1 907.52拷貝/μL，與第0、7、21、35天相比較，差異極顯著(P<0.01)。腎臟的病毒載量先升高后降低，在第7天達(dá)到峰值，混合感染組在第14天才達(dá)到峰值938.97拷貝/μL，與其他時(shí)間比較，差異顯著(P<0.05)。

A.PRV單獨(dú)感染組肝臟灰白色壞死灶； B.PCV2單獨(dú)感染組肝臟表面有壞死點(diǎn)； C.混合感染組肝臟有壞死點(diǎn)和壞死斑

A.PRV infection group,liver gray necrosis spots;B.PCV2 infection group,liver surface necrosis points;C.Mixed infection group,liver necrosis spots

圖3肝臟大體病理變化

Fig.3 Pathological lesions of liver

A.PRV感染組腎乳頭腫脹，腎盂蒼白； B.PCV2感染組腎乳頭腫脹出血；C.混合感染組腎出血淤血

A.PRV infection group,renal papillary swelling;B.PCV2 infection group,renal papilla swelling and bleeding;C.Mixed infection group,renal hemorrhage,congestion

圖4腎臟大體病理變化

Fig.4 Pathological lesions of kidney

A.PRV感染組肝血竇紅細(xì)胞滲出；B.PCV2單獨(dú)感染組肝臟匯管區(qū)大量出血； C.混合感染組肝小葉內(nèi)大量紅細(xì)胞滲出,肝細(xì)胞索

A.Hepatic cell red blood cell effusion in PRV infection group;B.Massive hemorrhage in liver confluence area of PCV2 infection group;C.Mixed infection group;massive red blood cell exudation in liver lobules;hepatic cords

圖5仔豬肝臟病理組織學(xué)變化(HE,400×)

Fig.5 Histopathological lesions of liver in piglets(HE,400×)

A.PRV感染組遠(yuǎn)曲小管管腔增大；B.PCV2單獨(dú)感染組腎小體內(nèi)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多；C.混合感染組遠(yuǎn)曲小管大量出血

A.Increased lumen of the distal convoluted tubule in the PRV infection group;B.Increased red blood cells and macrophages in the renal corpuscle of the PCV2 infection group;C.Large hemorrhage in the distal convoluted tubule of the mixed infection group

圖6仔豬腎臟病理組織學(xué)變化(HE,400×)

Fig.6 Histopathological lesions of kidney in piglets(HE,400×)

A.肝組織的陰性對(duì)照；B.PRV單獨(dú)感染組陽(yáng)性分布于肝組織匯管區(qū)；C.混合感染組PRV分布于肝細(xì)胞漿;D.腎組織的陰性對(duì)照；E.PRV單獨(dú)感染組陽(yáng)性分布于腎組織的致密斑處；F.混合感染組PRV分布于腎小體

A.Negative control of liver;B.PRV infection group was positive in hepatic tissue duct;C.Mixed infection group PRV was distributed in the cytoplasm of liver;D.Kidney tissue negative control;E.PRV infection group was positive distribution in the dense spots of renal tissue;F.Mixed infection group PRV distribution in the renal corpuscle

圖7免疫組化染色定位PRV觀察結(jié)果(SABC，400×)

Fig.7 Immunohistochemical staining for localization of PRV(SABC，400×)

A.PCV2單獨(dú)感染組陽(yáng)性分布于肝小葉邊緣；B.混合感染組PCV2分布于肝細(xì)胞漿;C.PCV2單獨(dú)感染組陽(yáng)性分布于腎組織的腎小體；D混合感染組PCV2分布于管腔上皮細(xì)胞

A.PCV2 infection group was positive in the margin of hepatic lobule;B.Mixed infection group PCV2 was distributed in the cytoplasm of liver;C.PCV2 infection group was positive in renal tissue of renal corpuscle;D.Mixed infection group PCV2 distribution in luminal epithelial cells

圖8免疫組化染色定位PCV2觀察結(jié)果(SABC，400×)

Fig.8 Immunohistochemical staining for localization of PCV2(SABC，400×)

由圖10可見(jiàn)，PCV2感染組肝臟內(nèi)病毒含量先升高后降低，第7天達(dá)到峰值 58.18 拷貝/μL;混合感染組肝臟病毒載量呈先升高,再降低，然后再升高，再降低，在第14天達(dá)到峰值，為635.28拷貝/μL，且其峰值是單獨(dú)感染PCV2峰值的10.9倍。PCV2感染組腎臟的病毒載量先升高后降低，在第14天達(dá)到峰值103.9拷貝/μL，混合感染組也在第14天達(dá)到峰值522.826 7拷貝/μL，此時(shí)混合感染組病毒載量是單獨(dú)感染組的5倍。

3 討論

本試驗(yàn)接毒后發(fā)現(xiàn)PCV2和PRV的混合感染后病情變得復(fù)雜，接毒后仔豬體溫迅速升高，混合感染時(shí)體溫在第10天迅速下降，低于正常值，表明PCV2和PRV可使仔豬抵抗力下降、迅速發(fā)病，混合感染則為新生仔豬發(fā)病率高、病死率高的重要原因。

PRV單獨(dú)感染組出現(xiàn)仔豬共濟(jì)失調(diào)、間歇性抽搐和擦墻的神經(jīng)癥狀，腹瀉與秦緒偉[11]研究結(jié)果相似；PCV2感染組有明顯的PDNS體征，與賈靜[12]研究結(jié)果相似。混合感染組仔豬既出現(xiàn)PRV感染所致的神經(jīng)癥狀，也有PCV2所特有的PDNS體征，并伴有仔豬呼吸困難、咳嗽、發(fā)熱、突然死亡等癥狀，與支霄剛[13]發(fā)現(xiàn)的野毒混合感染癥狀相似，說(shuō)明PRV和PCV2單獨(dú)感染對(duì)仔豬肝腎有損傷，混合感染損傷更甚，表明本試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有臨床參考價(jià)值。

A.肝臟;B.腎臟

A.Liver;B.Kidney

圖9感染仔豬肝腎PRV病毒載量變化圖

Fig.9 Changes of PRV viral loads in liver,kidney and liver of infected pigs

A.肝臟;B.腎臟

A.Liver;B.Kidney

圖10感染仔豬肝腎PCV2病毒載量變化

Fig.10 Changes of PCV2 viral load in liver,kidney and liver of infected pigs

PRV感染組剖檢肝臟表面出現(xiàn)灰白色壞死灶，腎臟表面出血，與董筱萍等[14]對(duì)遼西地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬病所做研究相似，本試驗(yàn)PRV單獨(dú)感染組腎臟乳頭腫脹出血，說(shuō)明本試驗(yàn)的PRV對(duì)仔豬腎臟損傷較大。胡玲玲等[15]發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒2型感染的仔豬出現(xiàn)肝臟有纖維素性增生膜，腎臟表而有針尖大小出血點(diǎn)及散在壞死點(diǎn)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCV2感染組腎臟病理變化與其結(jié)果一致，但并未發(fā)現(xiàn)肝臟有纖維素性增生?？赡艽嬖诘貐^(qū)差異導(dǎo)致PCV2感染后仔豬臟器受損不一致。混合感染組剖檢變化與支霄剛所觀察結(jié)果相似，對(duì)仔豬肝腎造成巨大的損傷。

組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，PRV單獨(dú)感染組對(duì)肝腎組織的損傷與付強(qiáng)等[16]的結(jié)果相似；PCV2單獨(dú)感染組對(duì)肝組織的損傷主要在肝小葉邊緣以及腎組織的腎小球和管腔?；旌细腥緦?duì)肝臟和腎臟的損傷程度大于兩個(gè)單獨(dú)感染組，可見(jiàn)豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型混合感染對(duì)仔豬危害極大。

原尿生成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是腎小球結(jié)構(gòu)的完整，腎小管和集合管受神經(jīng)體液因素調(diào)節(jié)，是機(jī)體調(diào)節(jié)水鹽平衡和酸堿平衡的主要部位[17]。肝細(xì)胞中含有大量的枯否氏細(xì)胞，可通過(guò)吞噬有毒物質(zhì)達(dá)到解毒效果[18]。本試驗(yàn)組織病理檢查發(fā)現(xiàn)，PRV和PCV2單獨(dú)感染可能造成仔豬解毒功能和排毒功能受損，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。付強(qiáng)等[16]的結(jié)果表明，PRV對(duì)仔豬肝腎均有損傷，PRV和PCV2混合感染對(duì)仔豬肝腎損傷較單獨(dú)感染嚴(yán)重。

Wen L B等[19]用免疫組化方法，在仔豬腎臟內(nèi)未檢測(cè)到PCV2的抗原，只在巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到了PCV2抗原。本試驗(yàn)檢測(cè)到PCV2分布于腎臟的腎小體細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞漿內(nèi)，可能由于本試驗(yàn)所用云南PCV2毒株毒力較強(qiáng)，可侵襲腎組織。PRV分布于肝細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度高、能夠定量，用于本試驗(yàn)病毒載量的測(cè)定。單獨(dú)感染組的肝腎PRV載量呈先升高后降低，肝臟載量在第3天達(dá)到峰值,腎臟載毒量則在第7天達(dá)到峰值，可能PRV的靶器官在病程發(fā)展過(guò)程中先是肝臟后為腎臟?；旌细腥窘M呈上升趨勢(shì)，雖然在第14天才達(dá)到峰值，但是肝和腎病毒載量遠(yuǎn)高于單獨(dú)感染組，且此時(shí)混合感染組仔豬已經(jīng)全部死亡。肝腎PCV2的載量變化趨勢(shì)同PRV載量。混合感染組肝腎載毒量均大于單獨(dú)感染組，在第14天達(dá)到峰值?；旌细腥臼辜膊∽兊脧?fù)雜，治療變得更為困難。