王新釗, 馬麗娟, 孫淑君, 繆應(yīng)業(yè)

解放軍第152醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.腫瘤科； 3.臨床實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467000

胃癌是全球性惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率較高，危害著人類的健康[1-2]。目前，胃癌的主要治療方式是手術(shù)，但是已發(fā)生轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良仍造成胃癌患者的死亡率居高不下。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程。近年來，臨床上采用抗癌藥物治療各類腫瘤的作用越來越受到重視。烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑，對(duì)多種蛋白酶的活性具有抑制作用，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和惡化的作用。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁主要通過作用于纖維蛋白酶激活因子、基質(zhì)蛋白酶、血管內(nèi)皮因子等，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于烏司他丁對(duì)胃癌的作用機(jī)制研究較少。本研究采用了不同濃度的烏司他丁作用于體外培養(yǎng)的人胃癌MKN-45細(xì)胞，探討烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響，以及對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，以期為臨床治療胃癌提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人胃癌細(xì)胞系MKN-45購自美國(guó)ATCC，烏司他丁購自廣東天普生化有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，胰酶(含EDTA)購自美國(guó)Hyelone公司，Matrigel膠購自美國(guó)BD公司，四甲基偶氮唑(MTT)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、二甲基亞砜(Dimethyl sulphoxide, DMSO)、膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國(guó)Sigma公司，Transwell小室購自美國(guó)Corning公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜購自美國(guó)Pierce公司，β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體購自美國(guó)Abcam公司，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體購自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司。流式細(xì)胞儀購自美國(guó)BD公司，酶標(biāo)儀購自美國(guó)Bio-Rad公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自英國(guó)Syngene公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)與處理所有MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)于含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并加入質(zhì)量濃度為10 g/L的青-鏈霉素，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，2 d換液一次，待濃度達(dá)到80%，采用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶消化進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)期細(xì)胞加入不同濃度烏司他丁(400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、400 U/ml組、800 U/ml組、1 600 U/ml組，對(duì)照組加入等量的生理鹽水。

1.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力。將細(xì)胞密度調(diào)整5×104ml-1接種于96孔板上，按照上述方法加入不同濃度烏司他丁進(jìn)行處理，加入200 μl培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去孔內(nèi)溶液，每孔加入150 μl DMSO，酶標(biāo)儀中檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下細(xì)胞的吸光(OD)值。

1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106ml-1，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光，4 ℃染色15 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。每孔設(shè)置5個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將-80 ℃冰箱中的Matrigel膠置于4 ℃冰箱中融化，與300 μl無血清培養(yǎng)基混合均勻，吸取100 μl加入Transwell上室，37 ℃孵育5 h。收集各組細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整為5×105ml-1，吸取100 μl細(xì)胞懸液加入上室上孔，下室加入500 μl含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；PBS清洗上室，棄去殘留液體，濕棉簽擦去剩余細(xì)胞和Matrigel膠，多聚甲醛固定30 min，500 μl質(zhì)量濃度為1 g/L結(jié)晶紫染色，37 ℃孵育30 min，顯微鏡下拍照、計(jì)數(shù)，取5個(gè)區(qū)域的平均值。

1.6檢測(cè)細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的變化棄去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的PBS液清洗3次，加入400 μl裂解液，4 ℃，12 000×g，離心15～20 min，吸取上清至無菌的EP管中。按照說明書配置相應(yīng)濃度的分離膠和濃縮膠，注入分離膠凝固30 min，加蒸餾水進(jìn)行封閉；棄去表面水分，加入濃縮較，插入梳子。吸取適量蛋白樣品與4倍體積的上樣緩沖液混合，煮沸10 min，12 000×g離心5 min，保存于-20 ℃冰箱中。將灌注好的聚丙烯酰胺凝膠置于電泳槽，加入電泳液，吸取30 μl蛋白樣品加入上樣孔，電壓為80 V，待條帶至分界線處，調(diào)整電壓100 V，電泳至條帶徹底分離，切斷電源。切下所需膠條，浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中，將PVDF膜輕泡在甲醛中2 min，然后電轉(zhuǎn)緩沖液中處理15 min；打開夾子，依次放入海綿墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊，冰浴中250 mA轉(zhuǎn)膜50 min；于質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶粉中封閉1 h；加入一抗與PVDF膜4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min；加入二抗，37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min，避光，加入ECL工作液，凝膠成像系統(tǒng)中記錄光密度值，Quantity One分析與內(nèi)參β-actin的比值。

2 結(jié)果

2.1烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，不同濃度烏司他丁對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞增殖均具有顯著的抑制作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與400 U/ml組相比，800 U/ml組、1 600 U/ml組細(xì)胞的增殖顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與800 U/ml組相比，1 600 U/ml組細(xì)胞的增殖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲的影響Tab 1 The effect of Ulinastatin on proliferation, apoptosis, and invasion of MKN-45 n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與400 U/ml組相比，bP<0.05。

2.2烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如表1、圖1所示，與對(duì)照組相比，不同濃度烏司他丁均顯著促進(jìn)胃癌MKN-45細(xì)胞凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與400 U/ml組相比，800 U/ml組、1 600 U/ml組細(xì)胞的凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與800 U/ml組相比，1 600 U/ml組細(xì)胞的凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡的影響Fig1 The effect of Ulinastatin on apoptosis of MKN-45 cells

2.3烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞侵襲的影響采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，不同濃度烏司他丁均顯著抑制胃癌MKN-45細(xì)胞侵襲,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與400 U/ml組相比，800 U/ml組、1 600 U/ml組細(xì)胞的侵襲數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與800 U/ml組相比，1 600 U/ml組細(xì)胞的侵襲數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響采用Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度烏司他丁對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的影響，結(jié)果如表2、圖2所示，與對(duì)照組相比，不同濃度烏司他丁均顯著抑制NF-κB p65、Bcl-2蛋白水平，Bax蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與400 U/ml組相比，800 U/ml組、1 600 U/ml組細(xì)胞NF-κB p65、Bcl-2顯著降低，Bax蛋白顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與800 U/ml組相比，1 600 U/ml組細(xì)胞的NF-κB p65、Bcl-2蛋白水平明顯降低，Bax蛋白明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平的影響Fig 2 The effect of Ulinastatin on NF-κB signaling pathway related protein levels in MKN-45 cells

組別NF-κB p65Bcl-2Bax對(duì)照組1.125±0.2170.894±0.0920.345±0.048400 U/ml組0.863±0.086a0.674±0.065a0.527±0.056a800 U/ml組0.532±0.058ab0.369±0.038ab0.865±0.078ab1 600 U/ml組0.387±0.041abc0.213±0.024abc1.246±0.219abc

注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與400 U/ml組相比，bP<0.05；與800 U/ml組相比，cP<0.05。

3 討論

烏司他丁是一種包含143個(gè)氨基酸的蛋白酶抑制劑，能夠抑制多種蛋白酶、糖和脂類水解酶的活性，能夠清除機(jī)體內(nèi)的氧自由基、抑制炎性因子的水平以及穩(wěn)定溶酶體膜等多種作用。目前，臨床上常采用烏司他丁治療急性胰腺炎、改善患者的免疫狀態(tài)等。但研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移具有較好的抑制作用。在乳腺癌中，烏司他丁可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2和基質(zhì)金屬蛋白酶9的活性，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲等[7]。另外，烏司他丁還可抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，烏司他丁可作用于細(xì)胞中的透明質(zhì)酸酶、乙酰肝素酶和影響細(xì)胞黏附因子相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮腫瘤的抑制作用。

本研究采用體外培養(yǎng)人胃癌MKN-45細(xì)胞，觀察了400 U/ml、800 U/ml、1 600 U/ml的烏司他丁對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及NF-κB信號(hào)通路的影響。MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比，烏司他丁顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖。隨著濃度的增加，800 U/ml與1 600 U/ml烏司他丁對(duì)細(xì)胞的增殖能力無顯著影響，推斷烏司他丁濃度為800 U/ml可能為體外較適宜的藥物濃度，Transwell小室法結(jié)果顯示，烏司他丁可抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的侵襲能力。隨著濃度的增加，800 U/ml烏司他丁與1 600 U/ml烏司他丁間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)800 U/ml烏司他丁為體外實(shí)驗(yàn)較適宜的濃度。

近年來，對(duì)藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)。Bcl-2家族成員是細(xì)胞凋亡過程的重要調(diào)節(jié)因子，主要包括Bcl-2(抗凋亡蛋白)、Bax(促凋亡蛋白)[10]。Bcl-2與Bax形成同源二聚體或異源二聚體，從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡。Bcl-2表達(dá)量增加可能是由于腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物具有一定抵抗作用，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，烏司他丁能顯著促進(jìn)胃癌MKN-45細(xì)胞的凋亡、下調(diào)Bcl-2蛋白水平、上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)量，隨著濃度的增加，Bcl-2逐漸降低，Bax逐漸增加。NF-κB信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能，是目前研究抗腫瘤藥物的潛在靶點(diǎn)之一[12]。p65是組成NF-κB蛋白的主要成員，在細(xì)胞質(zhì)中以二聚體的形式與核因子抑制蛋白(inhibitor of NF-κB, IκB)結(jié)合，抑制IκB酶的活性。當(dāng)機(jī)體受到腫瘤刺激、炎癥刺激以及其他刺激等，該復(fù)合物被激活，在細(xì)胞核中調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及侵襲、遷移功能[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，烏司他丁顯著抑制NF-κB信號(hào)通路的表達(dá)。與前人的研究[14]結(jié)果一致，烏司他丁通過抑制NF-κB信號(hào)通路活性阻礙乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，并抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。表明烏司他丁抑制胃癌MKN-45細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡，其作用機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，烏司他丁抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖是通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制其侵襲，為烏司他丁作為抗腫瘤生長(zhǎng)、侵襲的新藥提供新思路，而NF-κB信號(hào)通路可能是治療胃癌的潛在靶點(diǎn)。