沃春新 徐正濤 秦 樂 于子龍 張忠杰 陸 巍 姚 旌 王 林△

（1貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，貴陽550001；2貴州醫(yī)科大學(xué)麻醉系，貴陽550001）

骨骼肌是人體最大的器官，約占體重的40%。隨著年齡的增加、不良的生活習(xí)慣及社會因素等導(dǎo)致肌筋膜病變成為人體發(fā)生疼痛的常見原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示85%的疼痛門診病人都涉及到肌筋膜疼痛[1]。目前被廣泛接受的發(fā)生機(jī)制主要是Simons 在對“能量危機(jī)假說”補(bǔ)充修正后提出的“激痛點(diǎn)綜合假說”。治療上除傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、非甾體藥物、痛點(diǎn)阻滯等療法外，近年來體外沖擊波在治療肌筋膜疼痛也取得了良好的臨床療效。但對于體外沖擊波治療MPS的機(jī)制上國內(nèi)外較少報道。故本實驗擬通過建立MPS大鼠模型，采用體外沖擊波治療，觀察局部病理組織改變、肌電圖變化、熱痛閾的改變及脊髓組織nNOS、SP、5-HT、β-EP的表達(dá)。初步對體外沖擊波治療MPS大鼠的療效及機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療MPS提供理論依據(jù)。

方 法

1.動物與分組

成年健康SD大鼠24只，體重300～350 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為三組：C組、M組和S組，每組各8只。C組不進(jìn)行任何干預(yù)措施，正常飼養(yǎng)（室溫下，顆粒飼料飼養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)），M組造模完成后正常飼養(yǎng)，S組于造模后治療。

2.MPS模型制備

本課題組以改良后韓蓓的方法，已經(jīng)成功復(fù)制出大鼠MPS模型。方法：1% 戊巴比妥鈉溶液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：20150326）3 ml/kg行腹腔麻醉。大鼠仰臥、固定，自制重量為1 000 g的木質(zhì)打擊器，自20 cm的高度自由下落，打擊右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌，造成局部鈍挫傷。打擊接觸面積約為1 cm2，皮膚無破損。第2、3天，將大鼠放置于-16°電動跑臺（四通道WI32812，東西儀科技有限公司）上下坡跑（速度16米/分）持續(xù)90 min，采用聲和電驅(qū)趕大鼠以保證效果，后休息4天，以此方法連續(xù)干預(yù)8周。

3.體外沖擊波治療

造模后正常飼養(yǎng)4周，同上述麻醉方法后S組大鼠右股內(nèi)側(cè)肌處涂抹適量耦合劑后行沖擊波治療（瑞典storz MP100 沖擊波治療儀），用F15探頭0.16 mJ/mm2，300次，1.3 Hz，每5天一次，連續(xù)治療3次后正常飼養(yǎng)。

4.檢測指標(biāo)

（1）肌電圖：分別于T1、T2時點(diǎn)測肌電圖（T1實驗第12周，即模型復(fù)制完成時，T2：實驗第16周，即S組治療后第3周）。方法：將麻醉后大鼠，仔細(xì)尋找右股內(nèi)側(cè)肌部位緊張帶，用肌電圖儀（海神醫(yī)電 SN：ME 098）電極針緩慢插入緊張帶處，緩慢移動電極針約每次1 mm，至肌電圖顯示出自發(fā)電活動時，記錄下發(fā)生頻率。

（2）熱痛閾：分別于T1、T2時點(diǎn)測熱痛閾。用熱板實驗法，熱平板溫度為 52 ± 0.2℃，將大鼠置于熱平板上，記錄大鼠自接觸平板到抬起后爪或舔后爪的時間間隔。測量時間不超過45 s，以免造成組織損傷。連續(xù)測量3次，每次間隔時間大于20 min，取平均值做為熱痛閾值。

（3）病理形態(tài)學(xué)檢測及免疫組化法檢測脊髓nNOS、SP、5-HT、β-EP：1%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔麻醉后右側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉，行4%多聚甲醛固定。石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡 200 倍下觀察肌纖維的形態(tài)、 排列等變化。麻醉后大鼠，暴露心臟，將動脈套管針自左心室插入升主動脈，固定套管針，于右心耳處剪一小口，灌注4%多聚甲醛固定液100 ml固定。灌流后取大鼠脊髓L4-6腰膨大浸泡于4%多聚甲醛固定液中，置于4℃冰箱過夜保存。常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋，4 μm切片后予以3%過氧化氫滅活，1:100兔抗鼠一抗4℃孵育過夜，后山羊抗兔二抗室溫孵育30 min， 加SABC試劑20 min，二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 顯色，期間用PBS緩沖液沖洗，而后脫水、透明、封片。光鏡觀察切片，200倍視野下隨機(jī)選取4個，用數(shù)碼顯微鏡下攝片，陽性細(xì)胞率計數(shù)，取平均值。

5.統(tǒng)計學(xué)方法

所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，兩組均數(shù)的比較用單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.肌電圖

T1時，C組無自發(fā)電活動，因此放電頻率顯著低于M組和S組(P＜ 0.01)；M組和S組均見頻發(fā)的自發(fā)電活動，但兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；T2時，M組仍見頻發(fā)自發(fā)電活動，但S組自發(fā)放電頻率與M組相比顯著降低（P＜ 0.01，見表1）。

表1 三組大鼠右股內(nèi)側(cè)肌自發(fā)電活動、熱痛閾的比較(n= 8,x±SD)Table1 Spontaneous electrical activities of right vastusmedialis muscle and thermal pain threshold in three groups (n= 8,x±SD)

2.熱痛閾

T1時，M組和S組熱痛閾值與C組比顯著縮短(P＜ 0.01)，M組和S組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；但T2時S組熱痛閾時間延長（P＜ 0.01，見表1），說明沖擊波可以緩解大鼠的肌肉痛。

3.脊髓組織nNOS表達(dá)

nNOS 陽性染色為胞漿棕黃色。圖像分析結(jié)果顯示：與C組比較，M組nNOS顯著升高(P＜ 0.05)，而S組的nNOS較M組明顯下降（P＜ 0.05，見表2和圖1）。

表2 脊髓NOS、SP、5-HT、b-EP表達(dá)(n= 8,x±SD)Table2 Comparison of the expression of nNOS, SP and 5-HT in spinal cord between three groups (n= 8,x±SD)

圖1 大鼠脊髓nNOS 表達(dá)A：C組；B：M組；C：S組。標(biāo)尺 = 50 μmFig.1 The expression of nNOS in the spinal cordA: Normal, group C; B: Model, group M; C: Shock wave, group S.Bar = 50 μm.

4.脊髓組織SP表達(dá)

與C組比較，M組大鼠脊髓SP 表達(dá)顯著升高，而S組大鼠脊髓SP 顯著低于M組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05，見表2和圖2）。

圖2 大鼠脊髓 SP 表達(dá)A：C組；B：M組；C：S組。標(biāo)尺 = 50 μmFig.2 The expression of SP in the spinal cordA: Normal, group C; B: Model, group M; C: Shock wave, group S.Bar = 50 μm.

5.脊髓組織5-HT表達(dá)

三組大鼠脊髓5-HT 陽性表達(dá)無差異（見表2和圖3）。

圖3 大鼠脊髓 5-HT 表達(dá)A：C組；B：M組；C：S組。標(biāo)尺 = 100 μmFig.3 The expression of 5-HT in the spinal cordA: Normal, group C; B: Model, group M; C: Shock wave, group S.Bar = 100 μm.

6.脊髓組織b-EP表達(dá)

三組大鼠脊髓b-EP的表達(dá)無差異（見表2和圖4）。

圖4 大鼠脊髓 b-EP表達(dá)A：C組；B：M組；C：S組。標(biāo)尺 = 100 μmFig.4 The expression of β-EP in the spinal cordA: Normal, group C; B: Model, group M; C: Shock wave, group S.Bar = 100 μm.

7.病理形態(tài)學(xué)改變

C組大鼠肌肉縱切面顯示肌纖維緊密并規(guī)律，粗細(xì)均勻，細(xì)胞核多分散于肌纖維膜下且規(guī)則。M組大鼠肌肉組織縱切面肌纖維呈現(xiàn)粗細(xì)不同、排列紊亂及不同程度的粘連，并炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。S組橫切面可見肌纖維形態(tài)接近正常，但有少量不同程度的肌纖維輕微萎縮及變性（見圖5）。

圖5 右股內(nèi)側(cè)肌HE染色A：C組；B：M組；C：S組。標(biāo)尺 = 200 μmFig.5 HE staining of right vastusmedialis muscleA: Normal, group C; B: Model, group M; C: Shock wave, group S.Bar = 200 μm.

討 論

肌筋膜疼痛綜合征 (myofascial pain syndromes,MPS) 是以慢性肌肉疼痛且伴有一個或多個激痛點(diǎn)(trigger points,Trps) 為主要特征的常見軟組織疾病，是原發(fā)于肌肉、筋膜等結(jié)締組織且以頸肩腰背痛為特征的綜合征，主要因肌肉和筋膜無菌性炎癥而產(chǎn)生局部黏連攣縮而引起長期疼痛，遷延不愈。MPS到目前為止還沒有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療方案。本實驗參照韓蓓[2]大鼠MPS動物模型的制作進(jìn)行改良，大鼠經(jīng)打擊加運(yùn)動損傷后出現(xiàn)頻發(fā)右股內(nèi)側(cè)肌自發(fā)電活動、熱痛閾顯著降低，這可能是肌梭異常放電引起的，此類肌梭放電為不正常興奮的交感神經(jīng)刺激肌梭內(nèi)的肌纖維收縮所致；組織病理學(xué)可見模型組大鼠肌肉組織縱切面肌纖維呈現(xiàn)粗細(xì)不同、排列紊亂及不同程度的粘連，并炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象、梭形結(jié)節(jié)等，這與趙貞研等[3]關(guān)于大鼠肌筋膜疼痛激痛點(diǎn)的研究一致，進(jìn)一步證實MPS模型制備成功[4]。

目前臨床上針對肌筋膜激痛點(diǎn)的治療如注射局麻藥、口服非甾體抗炎藥、應(yīng)用肌肉松弛藥、物理療法和針刺療法等方面卻難以取得長時程的治療效果[5]。況且藥物的相關(guān)副作用及注射治療的創(chuàng)傷性，很多病人難以接受或不能依從。自1980年Chaussy[6]用體外沖擊波治療腎結(jié)石后，體外沖擊波的治療范圍逐漸從碎石、治療骨折不愈合、康復(fù)治療等轉(zhuǎn)向慢性疼痛治療領(lǐng)域，并因其治療的操作簡單、無創(chuàng)、不良反應(yīng)小、效果顯著等方面得到廣泛認(rèn)可。體外沖擊波療法作為一種非侵入性的物理治療方法逐漸被用于MPS治療中。而關(guān)于其對MPS的治療機(jī)制上卻很少報道。在本實驗中，經(jīng)體外沖擊波治療后大鼠組織病理切片中橫切面可見肌纖維形態(tài)與正常肌纖維接近；肌電圖檢查發(fā)現(xiàn)頻發(fā)自發(fā)電活動頻率明顯降低；熱痛閾測量時間延長。均是體現(xiàn)體外沖擊波對MPS大鼠治療有效的最直觀指標(biāo)。其治療機(jī)制可能是：由于打擊加運(yùn)動損傷后出現(xiàn)局部肌組織缺血和缺氧可刺激神經(jīng)血管反應(yīng)物質(zhì)的釋放，這些物質(zhì)使傳入神經(jīng)致敏其結(jié)果是：一方面損害了局部循環(huán)；另一方面是降低肌纖維組織的氧耐量，從而加重肌纖維的損害形成惡性循環(huán),最終產(chǎn)生能量的代謝危機(jī)[7,8]，形成緊張性肌纖維。多個緊張性肌纖維形成緊張性索條，即激痛點(diǎn)。而沖擊波是一種機(jī)械波，沿其傳播的方向引起介質(zhì)壓縮與膨脹，在交界面處產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力，從而引起軟組織間的彈性變形、松解；另一方面可以促進(jìn)血管擴(kuò)張，刺激血液循環(huán)和促使新的組織形成，同時刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的NO（氮氧化物）也有血管擴(kuò)張作用，增強(qiáng)膠原物質(zhì)合成，幫助肌腱的恢復(fù)[9]。其他相關(guān)報道：體外沖擊波的機(jī)械效應(yīng)與推拿作用類似，都可以松解粘連，降低肌張力，另外ESWT的空化效應(yīng)可以進(jìn)一步促進(jìn)微循環(huán)；化學(xué)效應(yīng)能夠促進(jìn)抑制疼痛物質(zhì)的釋放[10]。體外沖擊波在治療早期骨關(guān)節(jié)疾病、肌腱末端疾病以及糖尿病性潰瘍等疾病中都有獨(dú)特的治療優(yōu)勢，特別是在軟組織疼痛治療中，對肌肉、肌腱、肌腱附著點(diǎn)及筋膜處有明顯的緩解疼痛及松解作用。Silvia Ramon[11]認(rèn)為：沖擊波能夠?qū)ν从X神經(jīng)感受器的刺激，改變了感受器對疼痛的接受頻率及其周圍化學(xué)介質(zhì)的組成，抑制神經(jīng)末梢細(xì)胞，使神經(jīng)沖動無法傳遞，因此可緩解局部肌組織的疼痛。

此外，我們在本實驗中還發(fā)現(xiàn)沖擊波治療不僅能對外周肌筋膜起到鎮(zhèn)痛及緩解作用，還對脊髓水平神經(jīng)遞質(zhì)有一定影響。首先Mense認(rèn)為肌筋膜扳機(jī)點(diǎn)產(chǎn)生的外周傷害性刺激信號不斷向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳入，若相同或不同的骨骼肌上存在多個肌筋膜扳機(jī)點(diǎn)或肌筋膜扳機(jī)點(diǎn)持續(xù)存在能激活脊髓神經(jīng)元和脊髓以上的腦結(jié)構(gòu)。Kuan 等人發(fā)現(xiàn)在引起脊髓背角神經(jīng)元可塑性變化方面肌筋膜激痛點(diǎn)與脊髓之間的連接比正常組織（非肌筋膜激痛點(diǎn)）更有效，并且是與大量傷害性感受神經(jīng)元或小的感覺神經(jīng)元之間發(fā)生連接[12]。氧化氮是機(jī)體重要的信號分子，在細(xì)胞、神經(jīng)信息傳遞、血壓調(diào)節(jié)以及免疫活性中起重要作用。然而當(dāng)NOS促使NO生成過多，就成為引起神經(jīng)變性失調(diào)和神經(jīng)病理性痛的基本原因之一。一氧化氮NO已被證明是體內(nèi)重要的致痛信號物質(zhì)。一氧化氮是由 L-精氨酸和氧經(jīng)過多步氧化還原反應(yīng)生成，一氧化氮合酶是其生成的關(guān)鍵酶。NOS對疼痛的調(diào)控部位主要集中在脊髓背角的I和II層。在脊髓水平，炎癥等傷害性刺激可影響脊髓背角合成和釋放一氧化氮, 而使用基因剔除術(shù)或NOS阻斷劑，可阻鎮(zhèn)痛覺過敏的形成；NO升高在福爾馬林大鼠致痛模型中起著致痛的作用。NO可能參與腰椎間盤突出所引起的神經(jīng)根性疼痛, 腰椎間盤突出癥病人腦脊液中NO代謝產(chǎn)物含量明顯升高。在大鼠髓核移植模型的實驗中，術(shù)后1周移植的髓核組織NOS陽性細(xì)胞明顯增多，并且熱痛覺敏感性變化在此時最明顯，表明產(chǎn)生于移植椎間盤組織的NO可能與熱痛覺過敏有關(guān), 臨床上應(yīng)用NO抑制劑或拮抗劑治療腰椎間盤突出所引起的神經(jīng)根性疼痛也許會有好的療效[13]。本實驗研究顯示：經(jīng)過體外沖擊波治療MPS的大鼠，其脊髓nNOS水平顯著低于模型組大鼠，從而提高大鼠痛閾，減輕疼痛，這可能是其鎮(zhèn)痛治療機(jī)制之一。

脊髓背角淺層是將外周來源的傷害性信息及上位腦結(jié)構(gòu)發(fā)出的下行調(diào)節(jié)信息進(jìn)行綜合處理的重要區(qū)域，也是下行抑制系統(tǒng)實現(xiàn)其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的主要部位。研究結(jié)果表明：在多種慢性疼痛中，SP作為疼痛遞質(zhì)通過感覺神經(jīng)傳入纖維向上傳遞至脊髓中樞，參與疼痛在脊髓中樞的傳導(dǎo)和調(diào)制。SP作為神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛的感覺傳遞和鎮(zhèn)痛機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，大劑量時可直接引起感覺神經(jīng)元興奮，導(dǎo)致痛覺過敏。SP樣陽性纖維豐富地分布在脊髓背角的I、Ⅱ?qū)?，隨C或Aδ 纖維轉(zhuǎn)運(yùn)至脊髓背角釋放，傳遞傷害性信息，作為痛覺信息的主要指標(biāo)。胡國興等[14]發(fā)現(xiàn)大鼠左側(cè)后爪足底切口可增加同側(cè)脊髓背角SP樣免疫反應(yīng)。夏智群等[15]在大鼠右后足注射甲醛2h后發(fā)現(xiàn)脊髓背角I、II層SP免疫陽性物表達(dá)明顯增強(qiáng)。本實驗中，M組SP 顯著升高，S組大鼠脊髓SP 低于M組。提示體外沖擊波治療可降低脊髓背角SP的釋放，從而抑制傷害性刺激的傳入，對MPS大鼠起到鎮(zhèn)痛作用。

單胺類物質(zhì)是神經(jīng)遞質(zhì)的一大分支，包含5-HT、多巴胺和NE，其中5-HT 同時又為致痛物質(zhì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，在勞損和外傷情況下，導(dǎo)致頸肩部軟組織充血的炎癥性反應(yīng)，逐漸造成炎性粘連和纖維組織的增生。在病變過程中，小血管受炎癥反應(yīng)的影響，導(dǎo)致血管痙攣及5-HT和P物質(zhì)等釋放，這些物質(zhì)可以引起疼痛感覺，加劇軟組織的損傷和疼痛[16]。但我們實驗結(jié)果顯示5-HT指標(biāo)各組間均數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明體外沖擊波治療對MPS大鼠脊髓水平5-HT無影響。

β-EP廣泛存在于垂體中，是一種內(nèi)源性的類似嗎啡作用肽類物質(zhì)，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有廣泛的鎮(zhèn)痛作用，可以調(diào)節(jié)傷害性感受器，若水平下降，可造成機(jī)體痛覺過敏而產(chǎn)生疼痛， 并同時誘導(dǎo)P物質(zhì)的釋放，使疼痛加劇[17]。Smith等[18]報道神經(jīng)損傷的慢性疼痛小鼠在損傷后2、4、14 d損傷側(cè)脊髓內(nèi)腦啡肽的表達(dá)比對側(cè)及對照組降低, 并且在損傷后14 d最明顯。本實驗結(jié)果三組大鼠脊髓背角β-EP的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義。因個別MPS大鼠脊髓β-EP較高，可能與動物個體差異有關(guān)，希望在下一次的研究中進(jìn)一步加大樣本量，能否得出更加全面、精確的結(jié)果。

綜上所述，體外沖擊波可以通過降低病變肌筋膜自發(fā)電活動、提高痛閾值、促進(jìn)損傷肌筋膜的修復(fù)發(fā)揮治療作用，其機(jī)制可能與降低脊髓nNOS及SP水平有關(guān)。