朱曉冉，趙楠楠，李德海，符群

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

植物多酚是一種新型的天然抗氧化劑，與植物活性成分抗氧化性顯著相關(guān)[1]，由于其低毒、來源廣泛、無副作用且可有效拮抗體內(nèi)過剩的自由基、維持自由基平衡、抑制氧化損傷等優(yōu)點正受到廣大研究者的青睞。植物多酚廣泛存在于植物的根、皮、葉和果實中，是植物體內(nèi)復(fù)雜酚類次生代謝產(chǎn)物、芳香族羥基衍生物的總稱，包括簡單酚、香豆素類、萘醌類、夾氧雜蒽醌類、異黃酮類、黃酮類、木脂素類、單寧（包括水解單寧和縮合單寧）和酚酸類（苯甲酸類和肉桂酸類）衍生物等13類，其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)賦予植物多酚抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老和防治糖尿病、心腦血管疾病等多種生物功能[2~4]。

紅皮云杉（Picea koraiensis）又名虎尾松，高麗云杉，屬松科云杉屬常綠喬木，是我國分布較廣的樹種之一，主要分布在大興安嶺、小興安嶺、完達山和長白山林區(qū)等地區(qū)。研究表明松屬植物含有大量的萜類、多酚類和生物堿等活性成分。目前對植物多酚提取及抗氧化活性的研究相對較多，但對紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)降解穩(wěn)定性及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的研究尚未報道。Ali Liazid等[5]通過四種提取技術(shù)提取松子多酚，發(fā)現(xiàn)多酚抗氧化性和多酚含量有顯著的量效關(guān)系。Yi J等[6]研究發(fā)現(xiàn)松多酚能平衡氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)比例，防止失調(diào)、降低由氧化引起的疾病發(fā)生率。植物多酚的穩(wěn)定性將直接影響它的利用、運輸和保存等各個環(huán)節(jié)，溫度、pH、光、金屬離子和添加劑等因素均會對其產(chǎn)生影響[7]，因此研究并改善紅皮云杉種鱗多酚在食品加工貯藏過程中的穩(wěn)定性，對于深入研究其功能特性以及拓寬在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有非常重要的意義。

本試驗以紅皮云杉種鱗為原料，分別研究紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)在溫度、光照條件、pH、金屬離子和食品添加劑等不同處理條件下紅皮云杉種鱗中多酚含量及抗氧化穩(wěn)定性的變化，從而推斷影響紅皮云杉活性物質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，旨在充分利用紅皮云杉樹種資源，減少多酚類物質(zhì)在儲藏期間活性成分損失，為有效開發(fā)利用紅皮云杉多酚類物質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白山地區(qū)紅皮云杉種鱗；DPPH，美國 Sigma公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、X-5大孔樹脂、亞硫酸鈉、無水乙醇等其它試劑均為分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋DK-S12型，上海森信試驗儀器有限公司；JA2003萬分之分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-52A，上海亞榮生化儀器廠；RT-6000酶標(biāo)儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；紫外可見分光光度計TU-1810PL，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅皮云杉種鱗多酚的提取與純化

取適量紅皮云杉種鱗樣品置于一定體積分數(shù)的乙醇溶液中，室溫下抽提后，冷凍離心，相同條件下復(fù)提，收集提取液，離心，真空濃縮[8]，將濃縮液用處理后的X-5大孔樹脂純化，上樣量為1/3柱體積，流速為 2倍體積/h，60%乙醇作為洗脫劑，分段收集樣品，乙酸乙酯萃取后凍干于-20 ℃冰箱中備用[9]。

1.3.2 貯藏條件對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

準(zhǔn)確稱取紅皮云杉種鱗多酚凍干粉，乙醇溶解配置成一定濃度的多酚樣液，分別考察光照條件、貯藏溫度、pH值、金屬離子及添加劑對紅皮云杉種鱗多酚保留率及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的影響。

1.3.3 紅皮云杉種鱗多酚含量及保留率的測定

參照Molan[10]的方法，采用福林-酚法，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，溶液吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0103x+0.0308，R2=0.9995。

式中：C為提取液中多酚濃度，mg/mL；N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積，mL；M為原料質(zhì)量，g。

式中：X為處理后多酚含量(mg/g)；X0為處理前多酚含量(mg/g)。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

參考PRIOR[11]的方法，在2 mL樣液中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液，混勻室溫下避光靜置20 min后，在517 nm處測定吸光值，DPPH·清除率按下列公式計算。試驗設(shè)3組平行，結(jié)果取平均值。

式中：A0為樣品空白組吸光值；A1為樣品組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.5 總還原力的測定

參考You[12]的方法，并作出改動。樣液1.00 mL加入2.50 mL 1%鐵氰化鉀溶液，在50 ℃下反應(yīng)20 min，速冷后向溶液加入 2.50 mL 10%的三氯乙酸溶液，5 min后，加入5 mL去離子水，0.50 mL 0.1%三氯化鐵溶液，反應(yīng)30 min，在700 nm處測定吸光值。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（means±SD）表示，數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 21.0與Origin 8.5進行統(tǒng)計分析，以p<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 貯藏溫度對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

貯藏溫度的高低會影響活性成分的含量和功能，因此本實驗設(shè)計了幾種貯藏溫度對紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧功能影響的試驗，結(jié)果如圖1和2所示。

圖1 溫度對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.1 Effect of temperature on the content of polyphenols

由圖1可知，隨著溫度和時間的增加，總體上紅皮云杉種鱗多酚的保留率逐漸降低，不同溫度對多酚保留率的影響不同，4 ℃和25 ℃儲存條件下的紅皮云杉種鱗多酚含量損失差異不顯著，當(dāng)貯藏10 h時，多酚保留率分別為93.08%和87.23%。在70 ℃和100 ℃下儲存的多酚保留率下降顯著，貯藏10 h多酚保留率依次為61.45%和35.28%。紅皮云杉種鱗多酚的不穩(wěn)定性可能是因為多酚類物質(zhì)含有多個酚羥基，具有很強的還原性，發(fā)生自身的氧化聚合，多酚類物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致保留率降低[13]，而低溫下保存有良好穩(wěn)定性，可能是因為低溫抑制了多酚氧化酶與花青素褪色酶等酶的活性，減弱了對多酚的氧化作用，從而有效延緩了氧化、縮合及降解，因此低溫儲存多酚的穩(wěn)定性較好。

圖2 溫度對紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of temperature on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖2可知，隨著溫度的升高，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基和總還原力均降低，即體外抗氧化性呈減弱趨勢，這可能是因為高溫下多酚中的兒茶素特別是酯型兒茶素發(fā)生異構(gòu)化或者氧化分解反應(yīng)[14]，因此應(yīng)將紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)低溫保存[15]。

由圖1、2發(fā)現(xiàn)，4 ℃下10 h紅皮云杉種鱗多酚的保留率是100 ℃的2.64倍，4 ℃下DPPH自由基清除率、總還原力依次為100 ℃的1.99倍、2.21倍，多酚保留率下降倍數(shù)與抗氧化能力下降倍數(shù)接近，這是因為紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)的抗氧化性與多酚含量顯著相關(guān)，在以后的研究中需要探究紅皮云杉種鱗多酚抗氧化的量效關(guān)系。

2.2 不同光照條件對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

光照會引起多酚類物質(zhì)的降解，為了探究光照對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化能力的影響，本試驗比較了避光、室內(nèi)自然光、直射太陽光、紫外線輻射條件下紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧化功能的變化，試驗結(jié)果如圖3和4所示。

圖3 光照對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.3 Effect of light on the content of polyphenols

圖4 光照對紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of light on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖3可知，避光、室內(nèi)自然光、直射太陽光、紫外線可使紅皮云杉種鱗多酚發(fā)生不同程度的降解。避光下儲存的紅皮云杉種鱗多酚 10 d后的保留率為95.15%，室外直射日光和紫外線輻射儲存的紅皮云杉種鱗多酚10 d的儲存時間內(nèi)多酚含量變化較大，保留率分別為80.88%和65.95%，這主要因為光照破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，加快了多酚自身氧化聚合的速度，高凝軒等[16]研究發(fā)現(xiàn)黑果腺肋花楸多酚在紫外線下會加速分解，與本試驗結(jié)果一致，所以多酚應(yīng)避光保存。

由圖4可知，紅皮云杉種鱗多酚在4種光照條件下，抗氧化能力不同。室內(nèi)自然光照射下DPPH自由基清除率、總還原能力是避光條件下的 94.23%、88.46%，說明散射光對紅皮云杉多酚抗氧化能力有影響。在紫外輻射下，紅皮云杉種鱗多酚的DPPH清除率、總還原力是避光條件下的49.88%、41.10%，可能因為紫外線輻射破壞多酚的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，使多酚類物質(zhì)發(fā)生自身的氧化聚合，特別在長時間紫外線照射下，抗氧化能力顯著降低。避光下紅皮云杉種鱗多酚的保留率、DPPH自由基清除率、總還原力依次是紫外線輻射的1.44倍、2.00倍、2.43倍，下降趨勢的差異性可能是因為紫外輻射能夠破壞紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)中的原花青素等物質(zhì)。張衛(wèi)波等[17]研究發(fā)現(xiàn)米糠中原花青素在太陽光下照射15 d后相比避光條件下降34.31%，因此為了避免多酚抗氧化能力的損失，應(yīng)將多酚物質(zhì)避光保存[18]。

2.3 不同pH條件對紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能的影響

為研究酸堿性對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化能力的影響，本文選用pH 2、pH 4、pH 6、pH 8、pH 10進行試驗，結(jié)果如圖5和6所示。

圖5 pH對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.5 Effect of pH value on the content of polyphenols

由圖5可知，不同pH條件下，隨著時間的延長，紅皮云杉種鱗多酚含量都有不同程度的下降，在 pH 2、pH 4、pH 6條件下，多酚含量變化很小，保留率分別為92.84%、86.51%、76.23%。在pH 8、pH 10條件下，2 h內(nèi)多酚含量下降明顯，2 h后下降趨勢平緩，溶液出現(xiàn)少量沉淀，紅皮云杉種鱗多酚的保留率依次為58.65%、42.05%。相比堿性條件，紅皮云杉種鱗多酚在酸性條件下降解緩慢這可能是因為多酚含有多個酚羥基，呈弱酸性，酸性條件下氧化分解慢，堿性條件下多酚類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，且含有的羥基數(shù)目越多，在堿溶液中反應(yīng)越快，越不穩(wěn)定[19]。

圖6 pH對紅皮云杉種鱗多酚抗氧化的影響Fig.6 Effect of pH value on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖6可知，在pH 2和pH 4條件下，紅皮云杉種鱗多酚總還原力和清除DPPH自由基能力較強，表明在此pH值范圍內(nèi)多酚穩(wěn)定，有顯著的抗氧化活性。在 pH 8和 pH 10條件下，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH能力和總還原力顯著下降，這是因為堿性條件破壞多酚結(jié)構(gòu)，氧化生成醌類物質(zhì)[20]。由于多酚含酚羥基，呈弱酸性，因而酸性條件下有利于多酚抗氧化活性穩(wěn)定，但隨著pH的增大，OH-破壞了溶液的弱酸性，多酚氧化分解力度加劇，其穩(wěn)定性越來越差，這與圖5紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性的研究結(jié)果一致，但紅皮云杉種鱗多酚保留率和抗氧化能力下降趨勢不一致，pH 2下多酚的保留率、DPPH自由基清除率、總還原力依次是pH 10的2.21倍、4.56倍、2.79倍，這可能是因為堿性條件下紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)中的原花青素等物質(zhì)降解，導(dǎo)致抗氧化能力下降趨勢大于多酚的降解趨勢，因此在以后的研究中可探究貯藏條件對紅皮云杉種鱗原花青含量及抗氧化功能的影響。

2.4 不同金屬離子對紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能的影響

一些金屬離子與多酚類物質(zhì)會結(jié)合為絡(luò)合物，產(chǎn)生沉淀，影響多酚結(jié)構(gòu)及其抗氧化活性。本試驗分別測定幾種常見的金屬離子對紅皮云杉種鱗多酚降解及抗氧化能力的影響。結(jié)果如圖7、8、9所示。

圖7 金屬離子對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.7 Effect of metal ions on the content of polyphenols

由圖7可知，添加不同的金屬離子，對紅皮云杉種鱗多酚降解的影響不同，其中鈉、鉀、鈣離子對多酚含量影響較小，多酚保留率基本在85%以上。銅、鋅、鐵離子對多酚含量的影響顯著，且三價鐵離子使多酚溶液顏色迅速變深，多酚含量損失較大，保留率依次為 30.29%、35.19%、29.86%，這可能是由于加入銅、鋅、鐵三種金屬離子后，加速了溶液中多酚的氧化作用和催化反應(yīng)，使多酚含量下降損失。馬雙雙等[21]研究發(fā)現(xiàn) Fe3+、Fe2+、Al3+、Sn2+、Cu2+、Pb2+這6種離子對蓮子殼多酚具有顯著的破壞作用。

圖8 金屬離子對紅皮云杉種鱗多酚總還原力的影響Fig.8 Effect of metal ions on total antioxidant capacity of polyphenols

由圖8可知，添加不同的金屬離子，對總還原力的影響不同，其中鈉、鉀、鈣離子對紅皮云杉種鱗多酚總還原力影響作用較小，隨著鈉、鉀、鈣離子質(zhì)量濃度的上升，總還原力無顯著變化；添加鐵、銅、鋅離子顯著影響紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)總還原力，且隨著鐵、銅、鋅離子質(zhì)量濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)總還原力顯著降低。

這可能是因為鐵、銅、鋅離子與紅皮云杉種鱗多酚形成絡(luò)合物，而且鐵在d軌道上有空軌道，易于接受帶有孤對電子的紅皮云杉種鱗多酚，導(dǎo)致紅皮云杉種鱗多酚給質(zhì)子能力和表面疏水性降低，從而導(dǎo)致總還原力的降低[22]。

圖9 金屬離子對紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除能力的影響Fig.9 Effect of metal ions on the DPPH radical scavenging activity of polyphenols

由圖9可知，添加不同的金屬離子，對紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基的能力影響不同。其中鈉、鉀、鈣離子對紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除能力影響作用較小，而添加銅、鋅、鐵離子對紅皮云杉種鱗多酚DPPH自由基清除活性影響顯著，且隨著銅、鋅、鐵離子質(zhì)量濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基活性顯著下降，空白對照紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基的清除率依次是添加5%的銅、鋅、鐵離子的2.59倍、2.75倍、4.10倍，這與吳冬青等的研究結(jié)果一致[23]，綜上所述，在生產(chǎn)加工過程中應(yīng)避免紅皮云杉種鱗多酚與銅、鋅、鐵離子接觸。

2.5 不同濃度的蔗糖溶液對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

本試驗研究不同濃度的蔗糖溶液對紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性及體外抗氧化功能的影響，結(jié)果如圖10、11所示。

圖10 蔗糖對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.10 Effect of sucrose on the content of polyphenols

由圖10可知，不同濃度蔗糖溶液對紅皮云杉種鱗多酚有不同的影響。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著蔗糖溶液濃度的增加，蔗糖溶液對紅皮云杉種鱗多酚起保護作用，這可能是由于高濃度的蔗糖溶液降低水分活度，進而降低多酚的分解速率。雷月等[24]的研究結(jié)果也表明適宜濃度的糖溶液能增強多酚的穩(wěn)定性，因此可添加適宜濃度的蔗糖溶液，減少多酚的損失。

圖11 蔗糖對紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.11 Effect of sucrose on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖11可知，隨著蔗糖溶液濃度的上升，紅皮云杉種鱗多酚清除DPPH自由基能力增強，但紅皮云杉種鱗多酚總還原力在添加不同濃度蔗糖溶液吸光度數(shù)值上升緩慢基本不變，總還原能力無顯著變化，說明紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性的變化對不同的抗氧化指標(biāo)影響不一致，蔗糖對于多酚總還原力的影響不明顯[25]。

2.6 不同濃度的苯甲酸鈉溶液對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能的影響

本試驗研究了在添加不同濃度苯甲酸鈉的條件下0~10 h多酚含量的變化情況及不同濃度苯甲酸鈉溶液對紅皮云杉種鱗多酚體外抗氧化功能的影響，結(jié)果如圖12、13所示。

圖12 苯甲酸鈉對紅皮云杉種鱗多酚含量的影響Fig.12 Effect of sodium benzoate on the content of polyphenols

由圖12可知，不同濃度苯甲酸鈉溶液對紅皮云杉多酚穩(wěn)定性的影響不同。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著苯甲酸鈉濃度的增加，苯甲酸鈉試驗組的多酚保留率略高于空白組，對紅皮云杉種鱗多酚起到保護作用。在苯甲酸鈉質(zhì)量濃度為 0.1%時，多酚保留率最大，為95.08%?？赡苁怯捎诒郊姿徕c能夠有效抑制微生物，降低微生物對多酚的利用率[26]。因此可添加適宜濃度的防腐劑苯甲酸鈉，減少多酚的損失。

圖13 苯甲酸鈉對紅皮云杉種鱗多酚抗氧化能力的影響Fig.13 Effect of sodium benzoate on the antioxidant capacity of polyphenols

由圖13可知，添加不同濃度的苯甲酸鈉對紅皮云杉種鱗多酚總還原能力和DPPH自由基清除能力無顯著影響，這是因為苯甲酸鈉對紅皮云杉多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性無顯著影響，這與圖12的貯藏穩(wěn)定性的研究研究結(jié)果一致，汪志慧等[27]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈉、蔗糖、葡萄糖等食品原料和苯甲酸鈉、山梨酸鉀等防腐劑對蓮房原花青素的穩(wěn)定性影響不明顯，與本試驗的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本試驗研究了pH值、光照、溫度、金屬離子及添加劑對紅皮云杉種鱗多酚含量及體外抗氧化功能穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明貯藏條件對紅皮云杉種鱗多酚含量及抗氧化功能具有顯著影響，在4 ℃、避光條件、酸性條件下貯藏，紅皮云杉種鱗多酚保留率最高，且總還原能力和清除DPPH·能力最強。此外添加鈉、鉀、鈣離子對紅皮云杉種鱗多酚含量和抗氧化功能無顯著影響，而銅、鋅、鐵離子能夠顯著降低多酚含量和抗氧化功能。濃度超過30%的蔗糖溶液和0.1%苯甲酸鈉溶液能夠保護紅皮云杉種鱗多酚類物質(zhì)，但是隨著濃度的增加抗氧化功能無顯著差異。本試驗為紅皮云杉種鱗多酚穩(wěn)定性機理研究奠定理論基礎(chǔ)，并為有效開發(fā)利用紅皮云杉多酚類化合物提供科學(xué)借鑒。