李聰，熊海容，彭曉蔓，魏承亮，段麗，佘慧宇，張長城，袁丁,3，劉朝奇

（1.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，三峽大學(xué)，湖北宜昌 443002）（2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌 443002）（3.三峽大學(xué)附屬仁和醫(yī)院，湖北宜昌 443002）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的以肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。包括單純性脂肪肝（Simple fatty liver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)肝硬化[1～3]。近年來，NAFLD已成為發(fā)達國家和各地區(qū)最常見的慢性肝病，全球和我國大陸的 NAFLD患病率分別約為 25%和20%，且發(fā)病率呈不斷上升趨勢[4,5]。目前，NAFLD的治療主要包括生活方式的干預(yù)、藥物治療、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)以及手術(shù)外科干預(yù)等幾個方面[2,3,6,7]，然而，目前尚無明確有效的治療方式，因此尋求一種有效的干預(yù)NAFLD的發(fā)生發(fā)展藥物顯得極其重要。

c-Met，也被稱為酪氨酸蛋白激酶或肝細胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor，HGFR），具有酪氨酸激酶活性。肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）與c-Met結(jié)合并啟動細胞內(nèi)多個酪氨酸殘基的磷酸化，調(diào)節(jié)下游多個信號通路，介導(dǎo)細胞分化、增殖和血管生成等[8,9]。在肝組織中，HGF可能起保護免受肝損傷或加速再生過程的作用[10]。血管內(nèi)皮生長因子a（Vascular endothelial growth factor a，VEGFa）作為一種關(guān)鍵的促血管生成因子，在誘導(dǎo)血管生成、血管發(fā)生和內(nèi)皮細胞生長，促進細胞遷移和抑制細胞凋亡等方面具有重要的作用。MicroRNAs（miRNAs）作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，在肝臟的生成、分化及代謝過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。迄今為止，已經(jīng)提出miRNA在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用，包括miR-122，miR-24，miR-370，miR-378，miR-335，miR-125a-5p和 miR-33等[11,12]。另有文獻報道指出，miR199a-5p在NAFLD模型的小鼠肝臟組織中表達上調(diào)，調(diào)控肝臟中的脂質(zhì)代謝，在 NAFLD發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[13]。

木瓜為薔薇科植物貼梗海棠干燥近成熟果實，中醫(yī)認為木瓜有舒筋、活絡(luò)、健脾開胃、舒肝止痛、祛風(fēng)除濕之功效，可用于預(yù)防和治療風(fēng)濕病、霍亂、痢疾、腸炎、腳氣病及維生素C缺乏癥等[14]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木瓜提取物對小鼠肝纖維化有良好的干預(yù)作用[15]，為進一步研究該木瓜提取物對小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響及其可能的機制，本課題組進行了相應(yīng)的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗動物

SPF級昆明雄性小鼠40只，周齡為4～6周，體重為 16～20 g，由湖北省三峽大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號（（SCXK）（鄂）2011-0061）。

1.1.2 動物飼料

普通飼料由三峽大學(xué)實驗動物中心提供。高脂高糖飼料是由普通飼料、豬油、果糖、膽酸鈉、膽固醇、食鹽等混合而成，按照普通飼料(53%)、膽固醇(5%)、豬油（20%)、膽酸鈉(0.25%)、果糖(20%）、食鹽（1%）的重量比混合固定成型。用藥組飼料在高脂高糖飼料的基礎(chǔ)上采用木瓜提取物低劑量（100 mg/kg）和高劑量（300 mg/kg）加入飼料中，混合固定成型，送到武漢農(nóng)科院輻照滅菌備用。飼料營養(yǎng)成分見表1和表2：

表1 普通飼料營養(yǎng)成分表Table 1 Table of ordinary feed nutritional composition

表2 高脂飼料營養(yǎng)成分表（每kg飼料）Table 2 Table of High-fat diet nutrition composition

1.1.3 主要試劑

總RNA提取試劑盒，大連寶生物科技有限公司；膽固醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物科技有限公司；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔單抗 Met（SP260）（sc-162-R），上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit lgG（H+L），上海優(yōu)寧維生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器

實時定量PCR儀，德國Applied Biosysterms公司；Gene Genius凝膠分析系統(tǒng)，英國 SYNGNE公司；Gellogic 200凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Kodak公司；激光共聚焦顯微鏡（尼康A(chǔ)IR+），日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木瓜提取物的制備

木瓜，薔薇科木瓜屬，木瓜提取物的制備方法為將1000 g資木瓜粉碎成粗粉后加70%乙醇3500 mL浸泡，100 ℃回流蒸餾過濾后收集，重復(fù)2次。合并提取物，65 ℃懸蒸去乙醇并濃縮至1000 mL，離心取上清加入大孔樹脂內(nèi)。分別用10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇各 11000 mL為流動相，流速為10 mL/min。洗脫液分段收集，濃縮干燥，用于后續(xù)實驗研究。

其中10%乙醇洗脫組分的得率為6.6%，課題組將其命名為10%乙醇木瓜組分。前期，在細胞水平預(yù)試中10%乙醇木瓜組分顯示出了良好的降脂活性，為進一步研究木瓜提取物的藥理作用，課題組采用10%乙醇木瓜組分進行動物實驗研究。

1.2.2 非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立

SPF級昆明雄性小鼠40只，體重16～20 g，隨機將其分成4組，每組10只。分組依次為正常對照組，高脂高糖組，木瓜提取物低劑量組，木瓜提取物高劑量組。正常對照組用普通飼料喂養(yǎng)，高脂組采用自制的高脂高糖飼料造模，用藥組采用木瓜提取物低劑量（100 mg/kg）和高劑量（300 mg/kg）飼料喂養(yǎng)，按每只小鼠10 g/天給予，每兩天記錄1次體重，喂養(yǎng)1月后處死。

1.2.3 小鼠生化指標(biāo)的檢測

小鼠眼球取血后，將血液靜置30 min，轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心10 min，離心后取上清即為血清，用試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平；同樣用試劑盒檢測血清中膽固醇（TC）的水平。

1.2.4 肝臟組織HE染色

取10 mm×3 mm的新鮮肝臟大葉組織塊放入包埋盒中，于中性福爾馬林固定液固定，固定24 h后轉(zhuǎn)入75%乙醇中，4 h后再經(jīng)過常規(guī)脫水處理，石蠟進行包埋，然后切片（厚度4 μm），再進行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察肝組織病理變化情況。

1.2.5 RT-PCR檢測小鼠肝組織中 HGF、VEGFa和c-Met的表達

稱取凍存小鼠肝組織50 mg，采用TRIzol法提取小鼠肝臟組織的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，100 mA，20 min）檢測RNA的完整性。用微量核酸儀測定RNA的濃度，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，通過RT-PCR反應(yīng)擴增目的基因。引物序列見表3。

RT-PCR的反應(yīng)體系為25 μL體系，分別為滅菌雙蒸水 10.5 μL，2×PCR Master mix 12.5 μL，HGF、VEGFa和c-Met引物1 μL（引物為原液稀釋10倍），cDNA 1 μL。RT-PCR 實驗反應(yīng)條件：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；58 ℃、30 s；72 ℃、30 s；72 ℃、5 min；4 ℃，∞；RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液10 μL于2%瓊脂糖凝膠中電泳35 min，條件為100 V和100 mA，用凝膠成像系統(tǒng)檢測，觀察分析實驗結(jié)果。

表3 PCR引物序列Table 3 Primer sequences used for PCR

1.2.6 實時熒光定量 PCR檢測小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達情況

稱取凍存小鼠肝組織50 mg，采用TRIzol法提取小鼠肝臟組織的總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，100 mA，20 min）檢測RNA的完整性。用微量核酸儀測定RNA的濃度，再經(jīng)miR-199a-5p和U6特異性引物及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以U6為內(nèi)參，經(jīng)qPCR反應(yīng)擴增目的基因。反應(yīng)總體系為10 μL，分別為 SYBER Green 5 μL；RNase-free water 2.4 μL；引物 0.4 μL（引物為原液稀釋 10 倍）；cDNA 2 μL（為原液稀釋 10 倍）；ROX 0.2 μL。

反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 15 s；75 ℃ 1 s；cycles 40；72 ℃ 10 min；溶解曲線從56 ℃到98 ℃，每0.3 ℃讀取一次；引物序列見表2；PCR反應(yīng)結(jié)束后讀取CT值，利用軟件Opticon Monitor分析，計算2-ΔΔCT分析miR-199a-5p在各個樣本中的表達情況。

1.2.7 激光共聚焦顯微鏡（Confocal）觀察小鼠肝組織中c-Met表達情況

取10 mm×3 mm的新鮮肝臟大葉組織塊放入包埋盒中，于中性福爾馬林固定液固定，固定24 h后轉(zhuǎn)入75%乙醇中，4 h后再經(jīng)過常規(guī)脫水處理，石蠟進行包埋，然后切片（厚度4 μm）。

將石蠟切片置于60 ℃烤箱中，烤片1 h，脫臘，再進行高壓修復(fù)抗原10 min，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3遍，5 min/遍，5% BSA在27 ℃下封閉1 h；用PBS 配制一抗，抗體濃度1∶200，4 ℃孵育過夜（12～16 h），PBS沖洗3遍，5 min/遍；用PBS配制熒光二抗，抗體濃度1∶200，避光37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3遍，10 min/遍；然后用DAPI復(fù)染核5 min，PBS沖洗3遍，5 min/遍，最后使用抗熒光淬滅劑進行封片，激光共聚焦顯微鏡顯微鏡下觀察并取圖。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法

根據(jù)所得的實驗數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0軟件來進行數(shù)據(jù)分析，RT-PCR的結(jié)果利用Image J軟件分析，然后數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx ± s）來表示；同時利用單因素方差分析組間數(shù)據(jù)，以p＜0.05判定為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重變化情況及生化指標(biāo)檢測結(jié)果

根據(jù)測量小鼠體重變化情況，我們發(fā)現(xiàn)，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重增長明顯高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，（p＜0.01），藥物干預(yù)之后，小鼠體重增長有所下降，與高脂組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，（p＜0.05）。結(jié)果見表 4。高脂飼料喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)NAFLD模型，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂組小鼠血清中TC為10.40±1.30，與正常組（4.79±0.60）相比較其含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。檢測 ALT結(jié)果顯示，高脂組為 49.24±8.47，明顯高于正常組（42.90±5.79），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），這一結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致，達到NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，提示高脂飲食誘導(dǎo)脂肪肝模型血清結(jié)果成立。和高脂組相比，通過藥物干預(yù)之后小鼠血清中 TC、ALT的水平都是降低的，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。說明木瓜提取物具有降低小鼠血脂、改善肝功能的作用。見圖1。

圖1 小鼠相關(guān)生化指標(biāo)TC和ALT的檢測比較Fig.1 Comparison of serum TC and ALT levels in mice

表4 小鼠體重變化情況Table 4 Changes in body weight of mouse

2.2 HE染色結(jié)果

經(jīng)過組織切片HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常組小鼠肝組織中，其肝細胞形態(tài)清晰，排列規(guī)則，緊密而均一，肝索以中央靜脈為圓心，呈放射狀排列。高脂組小鼠肝臟中，肝細胞腫脹，形態(tài)模糊，排列紊亂，肝索結(jié)構(gòu)不清晰，并可見明顯的脂肪空泡，符合NAFLD的組織病理學(xué)改變[17]。

通過正常組和高脂組肝組織情況對比，并結(jié)合血清學(xué)檢測結(jié)果，提示非酒精性脂肪性肝病模型成立。另外，與高脂組相比，木瓜提取物低劑量組和高劑量組中可以觀察到肝細胞形態(tài)較清晰，排列較緊密，脂肪空泡有一定的改善，說明小鼠脂肪肝病理變化有一定的緩解。提示木瓜提取物對小鼠脂肪肝能起到一定的干預(yù)作用。這一結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致[18]結(jié)果見圖2。

表5 小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達情況Table 5 Expression of miR-199a-5p in mouse hepatic tissues

圖2 小鼠肝組織HE染色(200×)Fig.2 Hepatic tissues stained with HE from each group (200×)

2.3 實時熒光定量 PCR檢測小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達情況

圖3 Quantitative Real-time PCR檢測小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達Fig.3 Expression of miR-199a-5p in mouse hepatic tissues by Quantitative Real-time PCR

miR199a-5p的過表達能夠加劇游離脂肪酸（FA）的沉積，并且抑制ATP水平和線粒體DNA（mtDNA）含量，另外，抑制miR199a-5p能部分減輕FA的沉積并增加ATP水平和mtDNA含量，miR199a-5p在肝臟中的脂質(zhì)代謝，線粒體活性和線粒體β-氧化中起著至關(guān)重要的作用[11]。我們通過設(shè)計miR-199a-5p的莖環(huán)引物經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以U6為內(nèi)參，通過實時熒光定量PCR反應(yīng)檢測小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達情況，以正常組為標(biāo)準(zhǔn)參照，所得結(jié)果見表4和圖 3。與正常組相比較，高脂組小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），經(jīng)過藥物木瓜提取物的處理后，miR-199a-5p表達相較于高脂組其水平顯著降低，差異具統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），這一結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致，證實miR-199a-5p對小鼠NAFLD存在調(diào)控作用，且木瓜提取物能夠降低小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達水平，從而參與NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。

2.4 RT-PCR檢測小鼠肝組織中HGF、VEGFa和c-Met的表達

在肝損傷過程中，c-Met能夠觸發(fā)對于肝細胞恢復(fù)重要的存活信號，肝細胞中c-Met的缺失導(dǎo)致更多的肝細胞損傷和慢性膽汁淤積性肝損傷模型中的纖維化，這一作用是通過HGF/c-Met信號通路介導(dǎo)的[19]。

圖4 RT-PCR檢測基因HGF、VEGFa和c-Met的表達情況Fig.4 Expression of HGF, VEGFa and c-Met mRNA by RT-PCR

有文獻報道稱，miR-199a*可靶向 HGF/c-Met信號級聯(lián)，可以用作HCC的潛在治療靶標(biāo)。[20]越來越多的研究表明，miR-199a-5p在NAFLD的發(fā)生和發(fā)展及肝細胞的再生等過程中存在調(diào)控作用。[21]而從我們的實驗結(jié)果（圖 4）中可以看出，與正常組相比，高脂組中HGF、VEGFa和c-Met基因的表達均呈下降趨勢，且趨勢明顯，經(jīng)過灰度分析結(jié)果顯示其表達水平明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；經(jīng)過木瓜提取物干預(yù)之后，HGF、VEGFa和c-Met基因的表達與高脂組相比呈升高趨勢，趨近于正常組的表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），這一結(jié)果與相關(guān)文獻結(jié)果一致。綜合前面結(jié)果，與正常組比較，在高脂模型中，小鼠肝組織中miR-199a-5p的表達升高，而HGF、VEGFa和c-Met基因的表達呈明顯下降趨勢，通過木瓜提取的干預(yù)之后，miR-199a-5p的表達下調(diào)，HGF、VEGFa和c-Met基因的表達恢復(fù)，趨近于正常組，，認為木瓜提取物可能通過 miR-199a-5p調(diào)節(jié)HGF/c-Met信號通路干預(yù)NAFLD的發(fā)生與發(fā)展。

2.5 激光共聚焦顯微鏡（confocal）觀察小鼠肝組織中c-Met表達情況

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠肝組織中c-Met蛋白的表達水平（×200）Fig.5 The expression of c-met in each group(×200)

如圖5可看出，與正常組相比，高脂組中c-Met蛋白表達水平明顯降低，經(jīng)過藥物木瓜提取物干預(yù)后c-Met的表達水平是升高的；這一結(jié)果與相關(guān)基因表達的結(jié)果一致，進一步從蛋白質(zhì)水平顯示在高脂模型中c-Met的表達是降低的，通過木瓜提取物的干預(yù)之后，c-Met的表達得到恢復(fù)，接近正常水平，說明木瓜提取物可能通過抑制 miR-199a-5p的表達來促進c-Met的表達，從而達到改善脂肪肝的作用。

3 結(jié)論

3.1 研究發(fā)現(xiàn)高脂組的小鼠血清ALT及TC均高于正常組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），HE染色結(jié)果顯示高脂組肝組織中表現(xiàn)為肝脂肪樣變，脂質(zhì)沉積明顯，提示脂肪肝模型建立成功。RT-PCR、Quantitative Real-time PCR和激光共聚焦顯微鏡檢測，與正常組比較，高脂組的miR-199a-5p的水平升高（p＜0.05），HGF、c-Met及VEGFa的表達降低（p＜0.05），c-Met蛋白表達水平也明顯降低；經(jīng)木瓜提取物的干預(yù)后肝臟組織病理學(xué)變化明顯改善，脂質(zhì)沉積減少，ALT、TC水平降低（p＜0.05），miR-199a-5p的水平明顯降低（p＜0.01），HGF、c-Met及 VEGFa的表達恢復(fù)（p＜0.01），接近正常組，c-Met蛋白表達水平也明顯升高。

3.2 本研究的結(jié)果證實了在 NAFLD模型中，miR-199a-5p表達增加，抑制了HGF/c-Met-VEGFa信號通路，從而抑制肝細胞及血管的再生，造成肝功能的損害；經(jīng)過木瓜提取物的作用之后，miR-199a-5p的水平降低，相應(yīng)的HGF、c-Met及VEGFa基因的表達水平得到恢復(fù)，肝功能得到緩解。因此，我們認為miR-199a-5p-HGF/c-Met通路介導(dǎo)了脂肪肝的發(fā)生與發(fā)展，而藥物木瓜提取物能夠干預(yù)這一通路，通過降低miR-199a-5p的表達，使得HGF、c-Met及VEGFa表達增加，改善肝組織的脂質(zhì)積累，緩解脂肪肝的進程，該實驗為木瓜用于NAFLD的預(yù)防及治療提供了一個新的證據(jù)。