余道倫 左瑞華

（皖西學院，安徽 六安 237012）

鵝是我國飼養(yǎng)量僅次于鴨的水禽，作為一種節(jié)糧型的草食家禽，相較于其他家禽具有抗病力強、適應性廣、耐粗飼等特點。伴隨著生活水平的逐步提高，人們對鵝產品的需求，尤其是對鵝羽絨及其制品的需求正呈現(xiàn)逐年上升的態(tài)勢，已呈現(xiàn)出供不應求的局面，因此大力發(fā)展鵝業(yè)生產對農村產業(yè)結構調整、促進農民脫貧致富和提高國民生活品質等方面均具有積極而現(xiàn)實的意義。然而，目前鵝產業(yè)的發(fā)展卻十分緩慢，究其原因，主要是受到繁殖力低這一瓶頸的制約，如皖西白鵝，年產蛋僅20—25枚，嚴重制約了鵝規(guī)模養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。

家禽產蛋性能的高低除了受品種、環(huán)境及飼養(yǎng)管理等因素影響外，更為重要的是取決于卵巢中卵泡的生長和發(fā)育水平。家禽的卵泡發(fā)育是一個復雜的過程，與哺乳動物不同，禽類的卵泡發(fā)育、成熟的過程具有優(yōu)先等級的特點。原始卵泡經過募集開始發(fā)育進入等級前卵泡，由小到大經小白卵泡（small white follicule，SWF）、大白卵泡（large white follicule，LWF） 而進入小黃卵泡庫（small yellow follicule，SYF）。但大量的卵泡中僅5%能經過等級發(fā)育進入小黃卵泡階段。在產蛋期，每天只有一個SYF被選擇為優(yōu)勢卵泡并進入等級發(fā)育，成為排卵前卵泡，之后卵泡按照大小順序發(fā)育，直至排卵，排卵前卵泡按體積由小到大分為F5、F4…F1[2]。被選擇進入排卵前卵泡發(fā)育的卵泡數目越多，家禽的產蛋序列就越長，其產蛋性能越高。因此研究卵泡發(fā)育過程及調控對于提高家禽產蛋性能意義重大。禽類卵泡的發(fā)育和排卵與卵泡顆粒細胞的發(fā)育及其表面生殖激素受體的表達豐度有很大的關系，卵泡發(fā)育是受內外多因素調控的復雜生理生化過程[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)生殖軸激素如促卵泡素（follicule stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成素（luteinizing horomone，LH）是重要的調節(jié)因子，它們必須通過顆粒細胞表面表達的促卵泡素受體（FSHR）和促黃體素受體（LHR）介導才能作用于卵泡并調節(jié)卵泡的發(fā)育及排卵[5－6]。

本研究針對顆粒細胞在卵泡發(fā)育、成熟和排卵過程中的重要作用，對卵泡發(fā)育過程中的顆粒細胞層形態(tài)進行觀察研究，同時對表達于顆粒細胞上的FSHR和LHR進行定量研究，以期為深入研究鵝卵泡的發(fā)育與選擇機制提供試驗性資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

產蛋期皖西白鵝6只，PBS，Trizol試劑，二甲苯，無水乙醇，氯仿，異丙醇，電動研磨器，福爾馬林，伊紅染液，核酸蛋白分析儀，RT-PCR試劑盒，qPCR試劑盒，qPCR儀，光學顯微鏡（×100），離心機，渦旋振蕩器，液氮罐，研缽和杵，常規(guī)解剖器材等。

1.2 實驗方法

1.2.1 取材方法

將鵝處死后剖腹取出整個卵巢，并自卵巢上逐個分離大白、F5、F3和F1卵泡，其中3只鵝分離后的卵泡置于福爾馬林溶液中固定，另3只鵝分離后的卵泡置于PBS溶液去除卵黃后立即投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 石蠟切片制作和H&E染色

福爾馬林固定后的卵泡，經脫水、包埋、修塊等步驟后于切片機上按照5 μm厚度進行切片，制作的石蠟切片再經37℃烘箱烘烤過夜后即可置于室溫長期保存。

石蠟切片經過脫蠟、浸水、染核、分色、藍化、染質、脫水、透明和封片等步驟后即完成H&E染色。

1.2.3 卵泡組織總RNA提取（Trizol法）

從液氮中取出凍存的卵泡組織，放入提前預冷的研缽中，在液氮作用下快速將其研磨成粉末。稱取10—15 mg卵泡組織粉末于離心管中并加入1 mL Trizol試劑，電動研磨器研磨1 min使組織充分裂解，然后按照組織RNA提取標準程序提取卵泡組織總RNA樣品。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

獲得的總RNA樣品經核酸蛋白分析儀檢測后，樣品吸光度（OD）值A260/280在1.8—2.1區(qū)間，說明總RNA樣品提取質量滿足實驗要求。隨后立即將總RNA反轉為cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以鵝GAPDH基因為內參，對FSHR和LHR基因表達進行qRT-PCR檢測，qRT-PCR引物序列如表1所示。qPCR反應程序為：95℃預變性10 min；95℃變性 15 s，60℃退火 30 s，72℃延伸30s，40個循環(huán)。每個樣品和內參cDNA模板設3個重復。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復三次，所得數據利用 SPSS 19.0軟件進行 One-way ANOVA分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學差異，數據均以 means±SE表示。

表1 qRT-PCR引物

2 實驗結果

2.1 鵝卵泡取樣

鵝是季節(jié)性產蛋家禽，且產蛋具有間歇性，為便于取得鵝連續(xù)的卵泡樣品，本次實驗取材于鵝產蛋高峰期完成，取得的卵巢和卵泡形態(tài)如圖1所示。實驗共取得等級前卵泡SWF、LWF和SYF各若干枚，排卵前卵泡F5，F(xiàn)4…F1各一枚。本研究選擇其中的LWF、F5、F3和F1卵泡作為本次試驗的研究對象。

圖1 產蛋期鵝卵巢和卵泡形態(tài)

2.2 鵝等級卵泡顆粒細胞層形態(tài)觀察與比較

卵泡組織切片經H&E染色后，在光學顯微鏡下100倍油鏡鏡檢，結果如圖2所示。顆粒細胞層厚度伴隨卵泡等級發(fā)育自LWF、F5和F3逐漸增加，至F3達最大厚度，而后在F1突然下降。進一步的比較分析顯示F3卵泡顆粒細胞層厚度顯著高于其他卵泡（P＜0.05）。

圖2 不同等級卵泡顆粒細胞層厚度及其比較分析（×100）

2.3 等級卵泡顆粒細胞表面FSHR mRNA表達水平

等級卵泡顆粒細胞FSHR基因擴增情況如圖3所示。由圖3A可見溶解曲線目的基因和內參基因GAPDH都僅出現(xiàn)單一的溶解峰，無其他雜峰出現(xiàn)，說明實驗設計的引物是可行的。由圖3（B）可見FSHR表達從LWF緩慢上升至F3，而在F1卵泡階段突然下降。FSHR表達總體呈現(xiàn)的是先緩慢增加而后突然下降的趨勢。

圖3 目的基因FSHR mRNA在不同等級卵泡的qRT-PCR檢測結果

2.4 等級卵泡顆粒細胞表面LHR mRNA表達水平

等級前和排卵前卵泡LHR基因擴增情況如圖4所示。由圖4A可見溶解曲線目的基因和內參基因都僅出現(xiàn)單一的溶解峰，無其他雜峰出現(xiàn)，說明實驗設計的引物是可行的。由圖4（B）可見LHR基因表達在整個等級卵泡階段呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。

圖4 目的基因LHR mRNA在不同等級卵泡的qRT-PCR檢測結果

3 討論

3.1 采樣時間對連續(xù)卵泡樣品獲取的影響

鵝屬季節(jié)性產蛋家禽，根據鵝的產蛋生理以及鵝卵泡等級發(fā)育的特點，本次實驗鵝的取卵時間在鵝開產2個月后進行，此時鵝正處于產蛋高峰期。母鵝在繁殖周期中的產蛋期、就巢期以及休產期其體內卵泡的發(fā)育形態(tài)和數量差異較大，不同發(fā)育階段的卵泡會發(fā)生卵泡閉鎖或萎縮，卵泡發(fā)育停止和退化等生理現(xiàn)象。開產期母鵝卵巢上的等級卵泡生長發(fā)育活躍，卵巢腹側面出現(xiàn)大量等級前卵泡和部分排卵前卵泡，層次分明，沒有閉鎖卵泡。產蛋高峰期母鵝卵巢表面可觀察到大量的等級前卵泡和連續(xù)的排卵前卵泡，而原始卵泡呈靜止狀態(tài)[7]。從實驗結果來看，產蛋高峰期鵝卵巢上存在連續(xù)的卵泡序列，這一結果為開展鵝卵泡發(fā)育研究時進行卵泡樣品采集提供了試驗依據。

3.2 顆粒細胞在卵泡發(fā)育過程中的形態(tài)學變化

顆粒細胞與卵母細胞之間的相互作用是卵泡發(fā)育、成熟并成功排卵的內在機制[8]。本研究通過制作鵝等級卵泡的石蠟切片并對其進行觀察，對顆粒細胞的形態(tài)特征進行了初步研究。形態(tài)觀察結果表明：隨著等級卵泡的發(fā)育，顆粒細胞層發(fā)生了顯著變化，隨卵泡直徑的增加顆粒細胞層厚度呈現(xiàn)先增加后下降的態(tài)勢。這一結果暗示了顆粒細胞層厚度在卵泡發(fā)育前期逐漸增厚可能是為了將卵母細胞進行保護固定或逐步增強顆粒細胞調節(jié)卵泡發(fā)育能力而進行的組織形態(tài)適應過程，而在進入臨近排卵前階段厚度又逐漸下降，這可能是為卵母細胞破卵而出創(chuàng)造適宜的條件。本研究中鵝卵泡顆粒細胞層厚度在F3卵泡達最大厚度，這一結果與慈光新等對雞的等級卵泡顆粒細胞層進行觀察的結果一致[6]，說明卵泡顆粒細胞層隨卵泡等級發(fā)育的變化在鵝與雞上具有一定的相似性。此外，伴隨卵泡的等級發(fā)育，顆粒細胞層厚度逐漸增加，并在排卵前F3卵泡達最大厚度，隨后又在F1卵泡突然下降，據此，我們推測這可能是顆粒細胞在功能上為適應排卵需要而在形態(tài)上做出的主動性變化，其內在機理仍需進一步深入研究和探討。本研究結果為今后深入研究顆粒細胞發(fā)育奠定了形態(tài)學基礎。

3.3 FSHR和LHR mRNA在卵泡等級發(fā)育中的表達變化

卵泡的發(fā)育成熟并排卵是在體內多種激素的共同調控下完成的，垂體釋放的促卵泡素（FSH）和促黃體素（LH）是這些激素的代表，它們通過與顆粒細胞上相應的受體結合進而調控卵泡的等級發(fā)育過程，并最終促使卵泡成熟并排出體外[5-6，9]。FSHR和LHR是卵泡顆粒細胞上表達的垂體促性腺激素受體，其表達變化與卵泡發(fā)育成熟并排卵具有密切的內在聯(lián)系[10－11]。本實驗以顆粒細胞為研究對象，探討了FSHR和LHR兩種激素受體在鵝不同等級卵泡的表達情況。結果表明伴隨卵泡逐漸成熟FSHR mRNA表達量在F3卵泡達到最高峰，而在F1卵泡突降至最低，而LHR mRNA在卵泡發(fā)育中一直處于上升態(tài)勢，尤其是在排卵前卵泡階段，上升幅度更為明顯，這些結果與董霞等的研究結果一致[12]。另有其他研究表明，F(xiàn)SH可以促進未成熟卵泡快速發(fā)育，LH可以促進成熟卵泡排卵，在卵泡發(fā)育至排卵前卵泡階段，卵泡逐漸由FSHR依賴逐漸轉變?yōu)長HR依賴，為即將到來的排卵做準備[13－14]。本實驗結果中FSHR在F1突降以及LHR在排卵前卵泡一直處于上升趨勢，這些充分說明卵泡顆粒細胞為適應排卵需要可以在功能上做出主動性變化，以實現(xiàn)禽類的順利排卵。雖然目前僅就FSHR和LHR在顆粒細胞的表達變化進行了研究，尚不能在機制上詮釋顆粒細胞發(fā)育對卵泡成熟和排卵的具體作用，但是本研究結論為今后開展鵝卵泡等級發(fā)育以及相關產蛋生理研究積累了一定的參考性資料，對于FSHR和LHR是否與其他相關因子共同作用影響卵泡的發(fā)育在本實驗中未有涉及，還有待進一步深入研究和探討。

4 結語

綜上所述，本文針對鵝產蛋期卵泡的發(fā)育形態(tài)以及與卵泡發(fā)育和排卵密切相關的激素受體表達開展了初步研究。通過研究我們發(fā)現(xiàn)，鵝卵泡發(fā)育呈現(xiàn)連續(xù)的等級發(fā)育過程。通過進一步的分析我們推測顆粒細胞的發(fā)育狀態(tài)是鵝卵泡正常發(fā)育的內在動力，同時伴隨卵泡發(fā)育過程其表面激素受體表達水平亦發(fā)生相應變化，這些因素的共同作用促進了卵泡的連續(xù)發(fā)育以及成熟卵泡的順利排卵?？傊?，本研究結果為今后深入開展鵝卵泡的等級發(fā)育機制積累了形態(tài)學和分子生物學基礎。