成 亮，劉 盼，邢恒榮，張 莉

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801）

研究表明，植物在逆境環(huán)境中，轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)抑制或激活下游基因的表達(dá)從而更好地適應(yīng)環(huán)境的改變[6-7]。植物bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠與ABA響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的ABRE（ABA-responsive element）保守位點(diǎn)CACGTG結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)。擬南芥ABF/AREB類bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族共有4 個(gè) 基 因 ， 包 括 ABF1，ABF2/AREB1，ABF3 和ABF4/AREB2。其中，ABF1在響應(yīng)低溫反應(yīng)中具有非常重要的作用，而ABF2，ABF3和ABF4則響應(yīng)干旱、強(qiáng)酸、高鹽、高溫和氧化等逆境脅迫[8]。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中受到種種制約，例如病蟲害、干旱、鹽堿、水澇、高溫、冷寒等，這些逆境脅迫促使植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了可適應(yīng)環(huán)境變化的調(diào)控機(jī)理，使得植物在受到環(huán)境的刺激后能夠從基因分子水平進(jìn)行調(diào)控，從而抵御外界環(huán)境所帶來(lái)的威脅。因此，探明農(nóng)作物響應(yīng)非生物脅迫的分子機(jī)制并進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用受到越來(lái)越多的重視。

谷子（Setaria italica）是我國(guó)北方地區(qū)的主要農(nóng)作物之一，是一種抗旱、耐貧瘠、適應(yīng)能力強(qiáng)的作物，是植物抗逆性研究中理想的模型[9-10]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究谷子響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制并對(duì)谷子進(jìn)行改良，是提升谷子農(nóng)業(yè)應(yīng)用能力的一項(xiàng)重要的措施。

為了探索SibZIP8基因在谷子抗逆脅迫中的作用，本研究擬構(gòu)建SibZIP8基因的超量表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)揭示SibZIP8的調(diào)控機(jī)制，旨在為解析bZIP轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的谷子抗旱機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試谷子品種為晉谷21，表達(dá)載體為pCAMBIA1302，均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2 試劑

Taq酶來(lái)自上海勁馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；限制性內(nèi)切酶均為北京天恩澤生物有限公司產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為上海索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄酶、DNA凝膠回收試劑盒由上海伯易生物有限公司生產(chǎn)；RNA酶抑制劑、質(zhì)粒提取試劑盒和DH5α感受細(xì)胞均為天根生物化學(xué)科技有限公司產(chǎn)品；PCR引物的合成和測(cè)序由北京華大基因研究中心完成。

1.3 表達(dá)載體pCAMBIA1302-SibZIP8的構(gòu)建材料與方法

1.3.1 谷子總RNA的提取 在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站采集谷子嫩葉少許，在液氮中研磨，然后用RNA提取試劑盒提取，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，接著以mRNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.3.2 PCR擴(kuò)增：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction） 根據(jù)SibZIP8基因的CDS序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。在正向引物的5′端引入Nco1（CCATGG）酶切位點(diǎn)，在反向引物的5′端引入BstZ17I（GTATAC）酶切位點(diǎn)。

由圖4和表3可知，雙層干燥模式整體來(lái)說(shuō)，各干燥層的水分?jǐn)U散系數(shù)差異較小，平均值最大，約為1.1×10-4m2/s，原因是層數(shù)的變換使得風(fēng)速和溫度的分布相對(duì)均勻，物料中的水分能夠迅速蒸發(fā)，從而促進(jìn)了水分?jǐn)U散。lnMR和干燥時(shí)間線性相關(guān)系數(shù)高，各干燥模式不同干燥層的擬合系數(shù)R2均大于0.92。而3層干燥模式的水分有效擴(kuò)散系數(shù)均值最小，約為0.81×10-6m2/s，主要與干燥層數(shù)有關(guān)，層數(shù)增加使得風(fēng)速、溫度分布不均勻，影響水分轉(zhuǎn)移。

以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為擴(kuò)增模板。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性條件95℃，5min；變性條件95℃，30 s，復(fù)性條件 56 ℃，30 s，延伸條件 72 ℃，1 min，34次循環(huán)；72℃條件下延伸10 min。通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，有單一的明亮條帶，用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收。

1.3.3 pCAMBIA1302-SibZIP8超表達(dá)載體構(gòu)建取用含有pCAMBIA1302質(zhì)粒的大腸桿菌進(jìn)行搖菌，等菌液濃度達(dá)到OD600值為0.4～0.5后，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。pCAMBIA1302質(zhì)粒和上一步中純化的PCR產(chǎn)物同時(shí)用Nco1和BstZ17I進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，再用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)雙酶切后的線性化質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。雙酶切后的基因片段利用T4連接酶與線性化載體連接，用Ca2+處理DH5α細(xì)胞呈感受態(tài)以吸收重組載體進(jìn)入到受體細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒，即pCAMBIA1302-SibZIP8超表達(dá)載體，最后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，獲得白斑菌落，提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 SibZIP8的CDS擴(kuò)增和檢測(cè)

通過(guò)檢索谷子基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得SibZIP8 CDS序列（Si017618m），序列如圖1所示。

在正向引物5′端引入Nco1酶切位點(diǎn)和反向引物5′端引入BstZ17I酶切位點(diǎn)，得到擴(kuò)增引物序列如下。

下一步以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，以SibZIP8cDNA-F和SibZIP8cDNA-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

2.2 pCAMBIA1302-SibZIP8超表達(dá)載體構(gòu)建

采用1.3.3的試驗(yàn)方法，構(gòu)建pCAMBIA1302-SibZIP8重組載體，如圖3-A所示。用Nco1和BstZ17I雙酶切pCAMBIA1302-SibZIP8，然后進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3-B所示，SibZIP8基因已經(jīng)成功與載體進(jìn)行了連接。

為了進(jìn)一步確認(rèn)pCAMBIA1302-SibZIP8是否構(gòu)建成功，本研究選擇酶切成功的2號(hào)克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物如下。

測(cè)序比對(duì)結(jié)果如圖4所示，表達(dá)載體中連接的基因片段序列與SibZIP8基因的CDS序列一致，表明目的基因已成功連接到了表達(dá)載體上，超量表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 討論

bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠參與調(diào)控多種植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，在植物抵抗逆境脅迫等過(guò)程中也起著非常重要的作用[11]。SiZIP基因作為轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)調(diào)控下游一些靶基因的表達(dá)，在植物逆境脅迫的條件下發(fā)揮作用。YING等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)玉米ZmbZIP72轉(zhuǎn)錄因子，能夠明顯增強(qiáng)擬南芥對(duì)干旱與高鹽脅迫的耐受性。煙草ThpbZIP1和LEA基因的協(xié)同表達(dá)，可增強(qiáng)煙草在逆境脅迫下的耐受性。此外，臘梅在脫落酸、高溫、低溫、高鹽和干旱等逆境脅迫下，LEA基因可以誘導(dǎo)表達(dá)[13]。BALOGLU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫條件下，黃瓜的某些bZIP基因會(huì)表現(xiàn)出下調(diào)或者上調(diào)的趨勢(shì)。

劉寶玲等[15]利用生物信息學(xué)的分析方法，系統(tǒng)地分析了谷子SibZIP轉(zhuǎn)錄因子家族，得到較為完整的谷子bZIP基因家族信息。谷子基因組共編碼75個(gè)SibZIP轉(zhuǎn)錄因子基因，可劃分9個(gè)亞家族。其中，SibZIP8基因在谷子各組織中的表達(dá)量變化較大。為了探索該基因的功能，本研究構(gòu)建了SibZIP8基因的超量表達(dá)載體，下一步將轉(zhuǎn)化谷子進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證?？傊?，本研究結(jié)果將為解析bZIP介導(dǎo)的谷子抗旱機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物抗逆性提供候選基因。