陳熙 郭健民 鄒軍

1溫州醫(yī)科大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院（溫州 325035）

2上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)科學(xué)學(xué)院（上海 200438）

3上海體育學(xué)院發(fā)展規(guī)劃處（上海 200438）

在人體內(nèi)，成骨細(xì)胞的骨生成作用和破骨細(xì)胞骨吸收作用共同作用于骨量的動(dòng)態(tài)平衡，維持骨健康。運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)骨生成，保持該動(dòng)態(tài)平衡維持在較高的骨量水平；對(duì)其機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，單純的機(jī)械應(yīng)力刺激是其重要的調(diào)節(jié)因素[1]。相反，骨骼長(zhǎng)期處于低應(yīng)力的狀態(tài)下則會(huì)造成骨量的丟失，并伴隨著骨強(qiáng)度的降低，嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)生骨質(zhì)疏松癥及應(yīng)力性骨折等，如宇航員在失重的環(huán)境下生活，每月髖部的骨量丟失甚至達(dá)到了2%[2]。在體動(dòng)物和離體細(xì)胞水平的研究均指出，各種機(jī)械應(yīng)力包括牽張力、流體剪切力、壓應(yīng)力等可以對(duì)體內(nèi)骨組織細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSC）、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞產(chǎn)生刺激，促進(jìn)成骨增殖和分化[3-5]。但是機(jī)械應(yīng)力的參數(shù)如強(qiáng)度、頻率和刺激時(shí)間對(duì)細(xì)胞分化作用的影響較大，即適宜的應(yīng)力刺激可以促進(jìn)向成骨方向分化，強(qiáng)度和時(shí)間過(guò)大或過(guò)低均不利于成骨分化，甚至還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-8]。同時(shí)，機(jī)械應(yīng)力促成骨分化還具有細(xì)胞類型依賴性，不同的細(xì)胞類型具有不同的應(yīng)力刺激的生理適應(yīng)范圍，對(duì)應(yīng)力的耐受性也存在較大差異[9]。前期的研究主要采用腫瘤細(xì)胞系，對(duì)原代成骨細(xì)胞的研究相對(duì)較少，且機(jī)械應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響也尚未研究清楚，為更進(jìn)一步研究牽張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞分化和凋亡的影響，本研究將采用國(guó)際上應(yīng)用較多也較成熟的細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)——Flexcell-FX5000，對(duì)C57BL/6小鼠成骨細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械牽張應(yīng)力的干預(yù)，觀察不同強(qiáng)度和時(shí)間的牽張應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞分化和凋亡的影響，探討促進(jìn)成骨分化的適宜機(jī)械牽張應(yīng)力。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

Flexcell-FX5000細(xì)胞力學(xué)系統(tǒng)；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，USA）；流式細(xì)胞儀（Beckman FC500,USA）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（BioTek，USA）；α-MEM（Hyclone，USA）；胎牛血清（FBS）（Gibco，10099-141）；0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（碧云天）；細(xì)胞凋亡試劑盒（Annexin V-FITC/PI，BD PharmingenTM）。

1.2 細(xì)胞提取和培養(yǎng)

新生C57BL/6小鼠6只，無(wú)菌條件下取出顱蓋骨，D-Hanks液漂洗后剪成約0.5 mm×0.5 mm大小的骨碎塊，用α-MEM培養(yǎng)液（含10%FBS+100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素）潤(rùn)洗后貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，通過(guò)植塊法培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞。長(zhǎng)滿后用0.25%胰酶消化細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)液，于5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，每3天換1次液，長(zhǎng)至70%～80%融合的時(shí)候進(jìn)行1∶3傳代。傳至第3代時(shí)，取一瓶細(xì)胞通過(guò)堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）染色和茜素紅染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定（圖1）。

圖1 成骨細(xì)胞鑒定

1.3 施加牽張應(yīng)力

取第3代生長(zhǎng)良好的成骨細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)，胰酶消化后重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/ml后接種于Bio-Flex?Plate6孔板（底部為彈性硅膠膜，適用于細(xì)胞牽張專用），加培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)2天，換誘導(dǎo)分化液（含抗壞血酸L、β-甘油磷酸鈉）后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行牽張應(yīng)力干預(yù)（Flexcell-FX5000，USA）。分別采用3%、6%、12%形變幅度的正弦波，0.5 Hz頻率，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2、4、8、12 h的牽張干預(yù)，對(duì)照組細(xì)胞在相同環(huán)境下正常培養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻收集細(xì)胞。每組3個(gè)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.4 ALP活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS洗滌成骨細(xì)胞3次。之后每孔加入0.2%TritonX-100 2 ml裂解細(xì)胞后置于4℃過(guò)夜制備樣本，按照ALP試劑盒說(shuō)明書對(duì)樣本進(jìn)行ALP活性測(cè)定，詳見文獻(xiàn)[10]。

1.5 細(xì)胞凋亡水平分析

對(duì)收集的細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其凋亡水平。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，冰PBS洗滌3次，Binding Buffer緩沖液重懸細(xì)胞并調(diào)整至1×106/ml濃度，取100 μl細(xì)胞重懸液置流式管中，分別加入5 μl Annexin VFITC 和 5 μl PI，混勻后室溫避光 15 min，加入 400 μl Binding Buffer緩沖液終止反應(yīng)，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣本收集10000個(gè)細(xì)胞，采用儀器自帶的軟件CXP analysis進(jìn)行分析，分別統(tǒng)計(jì)正常細(xì)胞、早期凋亡、晚期凋亡細(xì)胞所占的比列。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，首先采用雙因素方差分析以明確牽張強(qiáng)度和時(shí)間因素對(duì)成骨分化和凋亡的影響作用，再采用單因素方差分析分別對(duì)同一強(qiáng)度下的時(shí)間因素進(jìn)行分析，組間比較采用Bonferrori法。使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成骨細(xì)胞ALP活性

雙因素方差分析顯示，強(qiáng)度因素和時(shí)間因素對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性均有顯著性影響，且兩者之間有交互作用。如圖2所示，3%和6%強(qiáng)度的機(jī)械牽張應(yīng)力干預(yù)可以顯著提高成骨細(xì)胞ALP活性（P＜0.05），且6%強(qiáng)度干預(yù)后促進(jìn)ALP活性的效果高于3%的強(qiáng)度。同時(shí)，在時(shí)間效應(yīng)上，這兩個(gè)強(qiáng)度干預(yù)均可使成骨細(xì)胞ALP活性先升高后降低，當(dāng)干預(yù)4 h和8 h時(shí)，ALP活性增加的效應(yīng)最大，其中6%強(qiáng)度連續(xù)干預(yù)4 h的效果最佳。12%強(qiáng)度應(yīng)力干預(yù)2 h時(shí)成骨細(xì)胞ALP活性出現(xiàn)先升高（P＞0.05）后降低的趨勢(shì)（連續(xù)干預(yù)12 h組P＜0.05，其余組別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。

圖2 各組別成骨細(xì)胞不同時(shí)間牽張干預(yù)后的ALP活性（n=3）

2.2 成骨細(xì)胞凋亡率

雙因素方差分析顯示，強(qiáng)度因素和時(shí)間因素對(duì)成骨細(xì)胞的凋亡均有顯著性影響，且兩者之間有交互作用。如圖3、4所示，進(jìn)一步采用單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行6%強(qiáng)度牽張干預(yù)時(shí)，細(xì)胞凋亡率（包括早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率）隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，其中4 h干預(yù)時(shí)細(xì)胞凋亡率最低，12 h干預(yù)時(shí)凋亡率最高；3%和12%強(qiáng)度干預(yù)時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)先保持不變，后出現(xiàn)顯著的上升趨勢(shì)，其中3%在前4 h干預(yù)細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），8 h和12 h干預(yù)后細(xì)胞早期凋亡率和總凋亡率出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），12 h干預(yù)組還出現(xiàn)晚期凋亡率顯著升高（P＜0.05）；而12%強(qiáng)度對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行牽張干預(yù)4 h后細(xì)胞凋亡率即出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞晚期凋亡率和總凋亡率都出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，而早期凋亡率則無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 各組細(xì)胞牽張干預(yù)后流式細(xì)胞代表圖

圖4 不同強(qiáng)度牽張刺激后成骨細(xì)胞的凋亡率（n=3）

3 討論

沃爾夫定律指出，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡受到機(jī)械應(yīng)力的影響。適宜的機(jī)械應(yīng)力則會(huì)促進(jìn)機(jī)體骨形成，其作用主要是由應(yīng)力通過(guò)細(xì)胞的力學(xué)感受器介導(dǎo)了一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Wnt、BMPs、MAPK、JNK等，激活BMSC向成骨分化、成骨細(xì)胞的分化以及增加骨細(xì)胞基質(zhì)的分泌等促進(jìn)骨生成[10-12]，同時(shí)抑制BMSC向成脂分化[13]。Guo等[14]研究發(fā)現(xiàn)，周期性牽張刺激不僅能增加BMSC的ALP、骨橋蛋白和I型膠原的表達(dá)，同時(shí)還抑制了破骨細(xì)胞系RAW264.7的分化，其機(jī)制可能是通過(guò)P38-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使BMSC向成骨分化。但不同的機(jī)械應(yīng)力參數(shù)（包括強(qiáng)度、時(shí)間、頻率、波形等）對(duì)成骨細(xì)胞分化作用的差異較大，甚至還會(huì)起負(fù)面作用。故本研究采用國(guó)際上廣泛應(yīng)用的細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)——Flexcell-FX5000[10-13]，對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行周期性牽張應(yīng)力加載，觀察不同強(qiáng)度和時(shí)間機(jī)械牽張應(yīng)力刺激后成骨細(xì)胞的凋亡水平。

成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，ALP分泌量逐漸增多，因此ALP活性可以作為成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志。本研究對(duì)C57BL/6小鼠的成骨細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度和時(shí)間的牽張應(yīng)力刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中（6%）、低（3%）強(qiáng)度的牽張應(yīng)力刺激可以顯著增加成骨細(xì)胞ALP活性，促進(jìn)成骨分化，且中等強(qiáng)度刺激在效應(yīng)量上要高于低強(qiáng)度刺激，這與本研究團(tuán)隊(duì)前期對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的研究結(jié)果一致[10]，提示在一定的強(qiáng)度范圍內(nèi)，牽張應(yīng)力促成骨分化的作用隨著強(qiáng)度的增加而增加。雖然有研究報(bào)告，高強(qiáng)度的牽張應(yīng)力也可以促進(jìn)成骨分化，如Tang等[15]對(duì)MC3T3細(xì)胞進(jìn)行牽張刺激，隨著牽張幅度的提升，細(xì)胞OPG的表達(dá)越來(lái)越多，而RANKL的表達(dá)則越來(lái)越少；李菲菲等[16]對(duì)Sao-2細(xì)胞進(jìn)行12%的牽張刺激后發(fā)現(xiàn)其可以增加ALP的活性，促進(jìn)成骨分化。但也有研究顯示，高強(qiáng)度牽張刺激會(huì)抑制成骨分化，如對(duì)ST2骨髓基質(zhì)細(xì)胞、HOB成骨細(xì)胞系的研究均發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度（＞10%）牽張刺激抑制細(xì)胞ALP活性和鈣化結(jié)節(jié)的形成[8,9,17]。本研究結(jié)果顯示，高強(qiáng)度（12%）牽張刺激后，C57BL/6小鼠成骨細(xì)胞的ALP活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，分析可能是高強(qiáng)度牽張過(guò)程容易對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，不利于成骨細(xì)胞的分化，而不同的細(xì)胞系對(duì)牽張強(qiáng)度的耐受性不同[9]，這也可能是本研究結(jié)果與Tang等和李菲菲等的研究結(jié)果不同的原因，提示牽張應(yīng)力促成骨細(xì)胞分化還具有細(xì)胞類型依賴性，不同的細(xì)胞類型具有不同的應(yīng)力刺激的生理適應(yīng)范圍。

在時(shí)間效應(yīng)上，本研究結(jié)果顯示，在6%強(qiáng)度下牽張4 h，成骨細(xì)胞的ALP活性最高，刺激8 h和12 h則ALP活性開始下降，但仍高于對(duì)照組；而3%強(qiáng)度牽張刺激下ALP活性的最高值則延長(zhǎng)至8 h，12 h牽張ALP活性開始下降，這些結(jié)果提示促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的牽張應(yīng)力具有強(qiáng)度和時(shí)間依賴性。高強(qiáng)度牽張?jiān)诖龠M(jìn)細(xì)胞分化的同時(shí)，也會(huì)引起細(xì)胞凋亡。如12%強(qiáng)度的牽張刺激激活了成骨細(xì)胞caspase-3和caspase-8的表達(dá)，增加了細(xì)胞凋亡率[18]；HOBs細(xì)胞系在10%強(qiáng)度牽張刺激下細(xì)胞的成活率下降，MMP-8/MMP-1的比值升高[19]；高強(qiáng)度的牽張和壓應(yīng)力刺激會(huì)使細(xì)胞白介素-6（IL-6）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP3和MMP-8的表達(dá)升高，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[20,21]。因此我們對(duì)應(yīng)力刺激后成骨細(xì)胞的凋亡狀況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12%強(qiáng)度牽張刺激下成骨細(xì)胞凋亡率在2 h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，與以上研究結(jié)果一致，這也解釋了高強(qiáng)度牽張應(yīng)力刺激下細(xì)胞的ALP活性甚至出現(xiàn)下降的原因。而在6%強(qiáng)度刺激下，細(xì)胞凋亡水平則出現(xiàn)先降低后上升的趨勢(shì)，其中4 h是臨界點(diǎn)，超過(guò)4 h的牽張應(yīng)力（8 h、12 h）則使細(xì)胞的凋亡率上升，該結(jié)果也與ALP活性在8 h和12 h相較于4 h下降一致。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間牽張刺激下（12 h）三個(gè)強(qiáng)度（3%、6%和12%）均表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡水平上升的趨勢(shì)，與強(qiáng)度關(guān)系不大，提示牽張應(yīng)力刺激下成骨細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)也具有強(qiáng)度和時(shí)間依賴性。另外，12%強(qiáng)度刺激主要是引起晚期凋亡率的增加，而3%強(qiáng)度刺激時(shí)是先引起早期凋亡的增加，后引起晚期凋亡的增加。這也提示了高強(qiáng)度的牽張更容易造成細(xì)胞凋亡至死亡，而低強(qiáng)度牽張刺激則需要長(zhǎng)時(shí)間刺激才會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷至死亡。

綜上所述，機(jī)械牽張應(yīng)力可以促進(jìn)C57BL/C小鼠成骨細(xì)胞分化，以6%強(qiáng)度的牽張干預(yù)4～8 h為宜。同時(shí)，牽張應(yīng)力還會(huì)影響成骨細(xì)胞的凋亡，6%強(qiáng)度牽張4 h細(xì)胞的凋亡率最低，增大牽張強(qiáng)度或者延長(zhǎng)干預(yù)時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡率增加。雖然細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與在體動(dòng)物有較大的差異，結(jié)果較難直接指導(dǎo)運(yùn)動(dòng)防治骨質(zhì)疏松中的強(qiáng)度和時(shí)間控制，但本研究的結(jié)果在細(xì)胞水平層面上驗(yàn)證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和時(shí)間的適宜性對(duì)于刺激成骨分化，減少凋亡具有重要的作用。