孫鳳俊 焦子康 薛建華 宣柏華 張佳誼

1 材料與方法

1.1 供體母牛選擇 供體母牛是位于北京市懷柔區(qū)的和牛生物科技（北京）有限公司飼養(yǎng)的空懷和牛，年齡為三四歲。

1.2 藥品與器械 促卵泡素（FSH）（貝爾尼奇公司FOLLTROPIN-V，400 mg NIH/瓶），黃體酮緩釋劑陰道栓CIDR（新西蘭DEC國(guó)際有限公司，黃體酮1．38 g/支），氯氣前列烯醇（齊魯動(dòng)物保健品公司，0．322 g/支），黃體酮（P4）注射液（寧波市三生藥業(yè)有限公司，2 mL∶50 mg/支）；苯甲酸鈉雌二醇（EB）注射液（寧波市三生藥業(yè)有限公司，2 mL∶4 mg/支）；沖卵液自配（含有10%FCS的PBS液），胚胎保存液及冷凍保護(hù)液均購(gòu)自貝爾尼奇公司，采卵管為二路式采卵管（規(guī)格為18#）和集卵杯購(gòu)自富士平公司。

1.3 超排方法與胚胎采集

1.3.1 超排處理方法 供體和牛超數(shù)排卵處理與胚胎采集于2017年3-4月在北京市懷柔區(qū)和牛生物科技（北京）有限公司和牛養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。供體牛超數(shù)排卵處理采用陰道栓+促卵泡素+PG方法進(jìn)行。超數(shù)排卵具體方法：在發(fā)情周期任意一天上午給供體牛放置陰道栓，同時(shí)肌肉注射黃體酮注射液（P4）100 mg和苯甲酸鈉雌二醇注射液（E2）2 mg，放栓當(dāng)日為0 d，第5～8 d超排處理按著每天2次遞減量肌肉注射Folltropin-V。促卵泡素采用Folltropin-V，連續(xù)4 d共8次遞減劑量注射方法，每頭供體牛超數(shù)排卵注射Folltropin-V總劑量分別為200、240、250、260 mg 4個(gè)組別[1]。

1.3.2 人工授精 供體牛放栓后第9 d早晚觀察發(fā)情，站立發(fā)情后12 h進(jìn)行第1次人工授精，精液為和牛常規(guī)冷凍精液，間隔12 h進(jìn)行第2次輸精。每次1支凍精，輸精部位子宮體。

1.3.3 胚胎采集與質(zhì)量鑒定 供體牛超排發(fā)情后第7 d（發(fā)情當(dāng)天為0 d）采用非手術(shù)法采集胚胎。每側(cè)子宮角使用250 mL左右沖卵液回收胚胎，反復(fù)沖洗六七次，回收液在集卵杯中，沖胚后，子宮內(nèi)灌注25～30 mL碘甘油，并肌肉注射2支氯前列烯醇。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用體式顯微鏡進(jìn)行檢胚，并根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定胚胎質(zhì)量，并將胚胎分為A級(jí)、B級(jí)、C級(jí)、退化胚胎和未受精卵，其中A、B、C級(jí)胚胎為可用胚胎，退化胚胎和未受精卵為不可用胚胎。A、B級(jí)胚胎具體鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：A級(jí)，表示胚胎形態(tài)完整、輪廓清晰呈球形、結(jié)構(gòu)緊湊，分裂球大小均勻、色調(diào)和透明度適中，無(wú)附著的細(xì)胞和液泡；B級(jí)，表示輪廓清晰、色調(diào)和細(xì)胞密度良好，可見(jiàn)到少量附著的細(xì)胞和液泡。

2 結(jié)果與分析

累計(jì)處理和牛供體34頭，共獲得總卵數(shù)299枚，頭均獲得總卵數(shù)8．79枚，第1～3組頭均獲總卵數(shù)分別為12．60、9．83、9．11枚，均高于第4組6．79枚，但差異不顯著（P＞0．05）；34頭供體累計(jì)獲得可用胚198枚，頭均獲得可用胚5．82枚，1～3組頭均獲得可用胚分別為6．00、7．17、5．67枚，均高于第4組5．29枚，但差異不顯著（P＞0．05），各組間也沒(méi)有顯著差異。然而，第1組不可用胚（6．60枚/頭）和退化胚（6．20枚/頭）顯著高于其他各組(分別為2．67枚/頭和0．67枚 /頭，3．44枚 /頭和 2．44枚 /頭，1．50枚 /頭和0．86枚/頭)，2～4組各組間差異不顯著（P＞0．05）。

3 討論

供體牛超排時(shí)，外源激素FSH劑量和注射時(shí)間及方法是直接影響超排效果的重要因素。FSH劑量過(guò)大時(shí)，供體卵巢反應(yīng)過(guò)度，影響卵母細(xì)胞質(zhì)量，從而降低了超排效果；而FSH劑量過(guò)低，又起不到超排作用。

本試驗(yàn)對(duì)三四歲成年和牛供體應(yīng)用Folltropin-V的劑量200～260 mg/頭，低于成年荷斯坦牛供體的劑量（400 mg/頭），平均可用胚也達(dá)到了5．82枚的良好效果。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，頭均獲得可用胚數(shù)量第1組260 mg組（6．00枚）、第2組250 mg組（7．17枚）和第3組240 mg組（5．67枚）均高于第4組200 mg組（5．29枚），但各組間差異不顯著（P＞0．05）。從可用胚數(shù)量看出，隨著FSH劑量的降低，超排效果也呈降低趨勢(shì)。另外，從胚胎質(zhì)量結(jié)果也可以看出，F(xiàn)SH劑量增加，不可用胚和退化胚數(shù)量也增多。說(shuō)明促卵泡素劑量過(guò)大，會(huì)產(chǎn)生不利效果。因此，超排應(yīng)根據(jù)不同品種牛供體對(duì)促卵泡素制劑的敏感性以及供體牛年齡和體質(zhì)量等因素，確定適宜劑量，從而達(dá)到良好的超排效果。本試驗(yàn)超排供體牛數(shù)量較少，同時(shí)供體牛個(gè)體差異較大，因此還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1]劉善齋，劉洪渝，涂曉華，等．和牛母牛超數(shù)排卵及胚胎移植試驗(yàn)研究效果初報(bào)[J]．中國(guó)牛業(yè)科學(xué)，2012（5）：12-14，20．