張淑霞 張清霞 司朝光 王媛 楊征 楊曉云

摘要：為了解大白菜抗根腫病品種的抗性表現(xiàn)及為育種利用提供依據(jù)，本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外抗根腫病大白菜品種資源進(jìn)行根腫病人工接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定。結(jié)果表明：94份接種青島根腫病菌的鑒定品種中有74.46%為抗病品種，其中表現(xiàn)免疫或高抗的占鑒定品種的65.95%；65份接種2012年雙龍根腫病菌的品種中12份表現(xiàn)抗病，占18.46%，其中表現(xiàn)高抗的有5份，占鑒定品種的7.69%；50份接種2013年雙龍根腫菌的品種中表現(xiàn)抗病的僅有2份，占鑒定品種的4%； KBrH129J18R分子標(biāo)記鑒定的86份品種中有56份出現(xiàn)抗病特征條帶，占鑒定品種的65.12%，抗青島根腫病菌的品種分子標(biāo)記中大都有抗病條帶出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：大白菜品種；根腫??；人工接種鑒定；分子標(biāo)記鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S634.103.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）05-0098-05

Abstract The clubroot resistance（CR）of Chinese cabbage varieties from home and abroad were identified by inoculation and molecular marker methods in order to know about their resisctance performance and breeding utilization. The results showed that 74.46% varieties showed resistance to Qingdao isolates of Plasmodiophora brassicae， in which immune or highly resistant varieties accounted for 65.59%. There were 18.46% varieties showing resistance to Shuanglong isolates collected in 2012， in which highly resistant varieties accounted for 7.69%. And only 4% varieties showed resistance to Shuanglong isolates which collected in 2013. Of the 86 varieties identified by KBrH129J18R molecular marker， the resistant bands were found in 56 varieties which accounted for 65.12%， and appeared in most of the varities which resistant to Qingdao isolates.

Keywords Chinese cabbage variety； Clubroot； Inoculation identification； Molecular marker identification

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染而引起的一種世界性土傳病害，在我國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，且日益嚴(yán)重，已成為大白菜的主要病害。選用抗病品種是對(duì)該病的根本防治方法。根腫病菌存在著生理小種分化，全世界已鑒定出生理小種24個(gè)以上[1]，我國(guó)報(bào)道的各地生理小種以4號(hào)為主，其他的還有2號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、13號(hào)生理小種[2-4]。抗根腫病基因位點(diǎn)也較多，目前已有8個(gè)抗病基因被報(bào)道 [5-11]。因此選用和選育抗病品種首先要明確抗病品種和抗源材料對(duì)不同生理小種或不同地區(qū)根腫病菌的抗性，而利用分子標(biāo)記能快速鑒定品種資源抗根腫病性狀。本研究在廣泛引進(jìn)國(guó)內(nèi)外抗根腫病大白菜品種的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同地區(qū)根腫病菌的抗病性接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在了解大白菜抗根腫病品種的抗性表現(xiàn)，以期為大白菜抗病育種的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大白菜品種為源于國(guó)內(nèi)外的95份抗根腫病大白菜品種，其詳細(xì)信息見(jiàn)表1，青研春白一號(hào)（CK1）、87-114（CK2）為感病對(duì)照品種（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供）。供試大白菜根腫病菌分別來(lái)源于青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大白菜87-114的根腫病腫塊（青島根腫病菌）、2012年采自云南昆明市盤(pán)龍區(qū)雙龍鄉(xiāng)的大白菜根腫病腫塊（2012年雙龍根腫病菌）、2013年采自云南昆明市盤(pán)龍區(qū)雙龍鄉(xiāng)的大白菜根腫病腫塊（2013年雙龍根腫病菌）。

1.2 人工接種鑒定方法

采用注射法對(duì)2012—2016年引進(jìn)的95份抗根腫病大白菜品種或試種樣品及感病對(duì)照品種進(jìn)行人工接種鑒定，72孔穴盤(pán)播種并接菌，接種孢子濃度為2×108個(gè)/mL，接種量為每穴1 mL[12]。

根據(jù)病情指數(shù)劃分抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I）：病情指數(shù)為0；高抗（HR）：0<病情指數(shù)≤11.11%；抗?。≧）：11.11%<病情指數(shù)≤33.33%；感?。⊿）：33.33%<病情指數(shù)≤55.55%；高感（HS）：病情指數(shù)>55.55%。

1.3 分子標(biāo)記鑒定方法

對(duì)95份抗根腫病大白菜品種中的86份及2份感病對(duì)照進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，采用本課題組經(jīng)多次驗(yàn)證結(jié)果穩(wěn)定的大白菜抗根腫病基因CRb的分子標(biāo)記KBrH129J18R。用改良CTAB法提取所用材料的全基因組DNA。提取到的基因組總DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-1000超微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA純度和濃度。PCR混合物反應(yīng)體積為10 μL，擴(kuò)增體系包括2 mmol·L-1的dNTP 0.2 μL，10×PCR Buffer 1 μL，25 mmol·L-1的MgCl2 1 μL，5 U·μL-1的TaqDNA聚合酶0.1 μL，100 mmol·μL-1的引物（上海生工）各0.05 μL，10 ng·μL-1的DNA模板3 μL，不足部分用ddH2O水補(bǔ)足。采用ABI Veriti梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃2 min→（94℃ 30 s→55℃ 30 s→68℃ 30 s）35個(gè)循環(huán)→68℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠恒功率電泳1.0～1.5 h，采用簡(jiǎn)易銀染法染色，顯影，借助燈箱讀帶，然后拍照并存檔。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接種鑒定結(jié)果

由表2可知，不同來(lái)源病菌對(duì)各品種的致病性不同，2013年雙龍根腫病菌致病力最強(qiáng)。用2013年雙龍根腫病菌鑒定的50份品種中只有金錦（編號(hào)為28） 和T1-07S（編號(hào)為71） 表現(xiàn)抗病，TI-11W（編號(hào)為73） 和CR-1（編號(hào)為85） 表現(xiàn)為感病，其他46份品種全部表現(xiàn)高感。65份接種2012年雙龍根腫病菌的品種中有12份表現(xiàn)抗病或高抗，占鑒定品種的18.46%，其中高抗品種5份，占鑒定品種的7.69%；94份接種青島根腫菌的品種中有70份表現(xiàn)抗病、高抗或免疫，占鑒定品種的74.46%，其中表現(xiàn)免疫或高抗的品種62個(gè)，占鑒定品種的65.95%，占抗病品種的88.57%。70份抗青島根腫病菌品種中只有LS-大白菜（編號(hào)為13）、金錦（編號(hào)為28）、利民（編號(hào)為30）和10070（CR）（編號(hào)為56）4個(gè)品種對(duì)2012年雙龍根腫病菌也表現(xiàn)高抗，其他大部分品種對(duì)其表現(xiàn)感病。而編號(hào)為1～25的大白菜對(duì)青島根腫病菌表現(xiàn)感病的品種中則有多個(gè)品種對(duì)2012年雙龍根腫病菌表現(xiàn)抗病。

2.2 分子標(biāo)記鑒定結(jié)果

2012 —2016年共計(jì)對(duì)上述95份接種鑒定品種中的86份進(jìn)行KBrH129J18R分子標(biāo)記鑒定，結(jié)果詳見(jiàn)表3，引物KBrH129J18R在部分品種中的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。86份分子標(biāo)記鑒定品種中出現(xiàn)抗病條帶的有56份，占鑒定品種的65.12%，70份抗青島根腫病菌的品種分子標(biāo)記中大都有抗病條帶出現(xiàn)，表明大部分抗青島根腫病菌的品種具有CRb基因；而編號(hào)為1～25大白菜品種（除19號(hào)品種外）對(duì)青島根腫病菌多表現(xiàn)為感病則沒(méi)有擴(kuò)增出抗病條帶，接種鑒定與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果基本吻合，因此對(duì)篩選具有CRb基因的抗病材料可以用KBrH129J18R等分子標(biāo)記直接鑒定篩選。編號(hào)為19、27、47、78、79共5份大白菜品種的分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與人工接種鑒定結(jié)果不一致，還需要重復(fù)驗(yàn)證。

3 小結(jié)

3個(gè)不同來(lái)源的根腫病菌致病力明顯不同，2013年雙龍根腫病菌致病力最強(qiáng)，抗源極少。2012年雙龍根腫病菌和2013年雙龍根腫病菌致病力的差異，也表明抗病品種的種植會(huì)導(dǎo)致根腫病生理小種分化致病力增強(qiáng)。

本研究結(jié)果表明目前我國(guó)的抗根腫病大白菜品種資源多數(shù)具有CRb抗病基因，與接種鑒定結(jié)果結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)同是具有CRb抗病條帶，28號(hào)、30號(hào)、56號(hào)品種不僅抗青島根腫病菌同時(shí)抗雙龍根腫病菌，表明這些品種應(yīng)該還具有其他抗病基因位點(diǎn)，是抗病育種的優(yōu)良抗源材料。

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