常淑芬

【摘 要】長期以來，棉花深受蟲害影響，導(dǎo)致棉花減產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)及重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將外源殺蟲基因?qū)朊藁ǐ@得轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已成為解決棉花蟲害的手段之一。本文綜述了常用外源殺蟲基因的種類、殺蟲機(jī)理及在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，并探討了抗蟲棉遇到的一些問題及今后的發(fā)展趨勢。

【關(guān)鍵詞】基因工程；抗蟲棉；抗蟲基因；研究進(jìn)展

【中圖分類號】S332.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】2095-3089（2018）22-0048-02

棉花不僅是一種重要的紡織原料，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。長期以來棉花深受棉鈴蟲、棉紅鈴蟲、甜菜夜蛾、玉米螟、蚜蟲等多種害蟲的侵害，其中以棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的危害最為嚴(yán)重。據(jù)調(diào)查顯示上世紀(jì)90年代，棉鈴蟲連年爆發(fā)，每年給國家造成的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)幾十億甚至幾百億。已成為限制棉花生產(chǎn)的重要因素。為了有效地防治棉鈴蟲等害蟲，通過各種技術(shù)手段培育抗蟲棉具有重要意義。其中利用基因工程培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是目前解決棉花蟲害的一種主要方法。

一、常用的外源殺蟲基因

一些微生物或動植物體內(nèi)能產(chǎn)生殺死昆蟲的毒蛋白，將這些毒蛋白基因?qū)氲矫藁ㄖ?，可賦予棉花抗蟲性。按導(dǎo)入的外源殺蟲蛋白基因分類，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉有Bt抗蟲棉、蛋白酶抑制劑抗蟲棉、外源凝集素抗蟲棉等。目前，在生產(chǎn)中應(yīng)用最多的主要是Bt抗蟲棉。

1.蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因（Bt基因）。

蘇云金芽孢桿菌是一類廣泛存在于自然界的革蘭氏陽性菌，代謝過程中能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白、δ-外毒素、β-外毒素等，主要對鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目等害蟲有毒害作用，研究還發(fā)現(xiàn)Bt對寄生線蟲、絳蟲等也有影響，但對人畜無毒害作用，因此在有害生物的治理中起著非常重要的作用。

2.蛋白酶抑制劑基因。

蛋白酶抑制劑在植物中廣泛存在，尤其在植物的種子中含量豐富，約占植物總蛋白的10%。迄今為止，蛋白酶抑制劑根據(jù)作用酶的活性位點(diǎn)的不同和氨基酸序列的同源性，分為4類：絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑分為Bowman-birk型、Kunitz型、PI-I型、PI-II型等，其中Bowman-birk型中的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（SKTI）對鱗翅目、鞘翅目、直翅目等多數(shù)農(nóng)田害蟲都有毒殺作用，在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中最為廣泛。其殺蟲機(jī)理是：CpTI能與害蟲消化道內(nèi)的蛋白消化酶緊密結(jié)合形成酶-抑制復(fù)合物，使害蟲體內(nèi)的蛋白消化酶被抑制，當(dāng)害蟲取食轉(zhuǎn)CpTI的植物時，就會抑制生長和發(fā)育，甚至死亡；同時，當(dāng)CpTI與害蟲體內(nèi)的蛋白消化酶結(jié)合后，會導(dǎo)致害蟲體內(nèi)蛋白酶的過量分泌，經(jīng)過神經(jīng)系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)，使害蟲產(chǎn)生厭食反應(yīng)。上述雙重效應(yīng)將減少昆蟲對植物蛋白的攝取及利用率，最終造成昆蟲因缺少必要的蛋白質(zhì)而停止發(fā)育甚至死亡[3]。由于CpTI對人畜沒有毒害作用，因而在轉(zhuǎn)基因中有很好的應(yīng)用前景。

3.外源凝集素基因。

外源凝集素是一類能特異識別并可逆地結(jié)合單糖或寡糖的蛋白或糖蛋白。在植物各組織器官中均有發(fā)現(xiàn)，尤以豆科植物的種子中含量最為豐富。目前人們已分離出多種外源凝集素，但大多數(shù)外源凝集素因?qū)Ω叩葎游镉卸竞ψ饔?，從而限制了它們在基因工程方面的?yīng)用。其中雪花蓮凝集素基因（GNA）對刺吸式和咀嚼式害蟲有毒性，可以抑制害蟲的生長甚至抑制其繁殖力，并且對其天敵、人畜等無害，在植物抗蟲基因工程方面正日益受到重視。

4.新型抗蟲基因。

除以上幾種主要的抗蟲基因外，昆蟲神經(jīng)毒素、淀粉酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶基因、陰離子過氧化物酶基因、核糖體失活蛋白基因、脂肪氧化酶基因等一些新的抗蟲基因正在被研究。

二、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉存在的問題

盡管轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在控制害蟲方面取得了很大的進(jìn)展，但在生產(chǎn)實(shí)踐中仍存在一些局限性，在實(shí)踐中也遇到了一些問題。

1. 抗蟲譜較窄，害蟲易產(chǎn)生抗性。

危害棉花的害蟲有幾百種，其中主要以棉鈴蟲、棉蚜、棉葉螨、斜紋夜蛾、棉紅鈴蟲的危害最為嚴(yán)重。目前世界各國培育和應(yīng)用的大多是Bt轉(zhuǎn)基因棉，這種抗蟲棉僅對棉鈴蟲、棉紅鈴蟲等極少數(shù)鱗翅目害蟲有抗性，對其他害蟲不具有抗性。相反還增加了其他害蟲的發(fā)生率，使一些次要害蟲上升為主要的害蟲。Wu等的研究表明，Bt轉(zhuǎn)基因棉雖然減少了棉鈴蟲的數(shù)量，但是并沒有減少蚜蟲、盲蝽蟓等害蟲的數(shù)量，Men等的研究則表明，Bt棉田的次要害蟲盲蝽蟓可能比非轉(zhuǎn)基因棉田的數(shù)量多。目前由于昆蟲動態(tài)數(shù)量的變化而導(dǎo)致次要害蟲對棉花生產(chǎn)所造成的損失已成為普遍現(xiàn)象，因此要不斷地研發(fā)抗蟲范圍更廣的抗蟲基因，培育廣譜性更強(qiáng)的抗蟲棉。

2. 外源抗蟲基因在棉花受害部位表達(dá)量低。

在目前轉(zhuǎn)基因植物中，驅(qū)動外源抗蟲基因在植物體內(nèi)的表達(dá)多采用組成型啟動子，如CaMV35S啟動子，使目的基因在植物體內(nèi)各部位平均表達(dá)，難以在受侵害部位形成較高的作用濃度，害蟲在長期的選擇壓下提高了對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的抗性幾率。因此有必要研究使外源抗蟲基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)特定的時間及特定的部位高效表達(dá)的方法。

3.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Bt毒蛋白表達(dá)的時空性。

（1）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Bt毒蛋白表達(dá)具有時間性。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著棉株的生長、發(fā)育、生殖組織出現(xiàn)、成熟、衰老，Bt毒蛋白的表達(dá)呈下降趨勢，即前期抗蟲性強(qiáng)，后期抗蟲性弱；而棉鈴蟲危害較嚴(yán)重的時期正處于棉花生長階段的后期。因此，抗蟲棉種植的后期應(yīng)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行化學(xué)防治，并結(jié)合生物防治，以降低蟲害。

（2）轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的Bt毒蛋白表達(dá)具有空間性。

即：棉株不同組織器官抗蟲性能存在差異，一般是營養(yǎng)器官高于生殖器官，其抗性順序?yàn)楣δ苋~>嫩頂葉>蕾>花。此順序也間接表明棉鈴蟲對轉(zhuǎn)基因棉花的為害有位置效應(yīng)。因此轉(zhuǎn)Bt毒蛋白的抗蟲棉在開花和成蕾期要結(jié)合化學(xué)防治，治理害蟲。

4.標(biāo)記基因的安全性。

目前，常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因和除草劑抗性基因，在轉(zhuǎn)基因棉花中常用的標(biāo)記基因是nptⅡ基因。雖然，nptⅡ基因已通過安全評價，但是其他標(biāo)記基因的使用可能對生態(tài)環(huán)境和人類健康等存在潛在的威脅，例如一些抗除草劑基因可以通過花粉、種子等傳播途徑與近緣野生種雜交，使近緣野生種獲得抗除草劑基因，若近緣野生種本身就是雜草，那么就有可能變?yōu)殡y以控制的“超級雜草”，還可能導(dǎo)致遺傳基因多樣性的丟失。另外，標(biāo)記基因及其產(chǎn)物還可能會影響人或動物的健康。

5.轉(zhuǎn)基因抗蟲棉易出現(xiàn)早衰、枯萎病、黃萎病。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在一定程度上實(shí)現(xiàn)了防治害蟲的目的，棉鈴脫落也大大減少，棉鈴成鈴高峰期提前，但早熟的同時，由于體內(nèi)大量的養(yǎng)分被消耗掉，會出現(xiàn)早衰?？瓜x棉發(fā)育過早，開花結(jié)鈴盛期提前，因此，伏桃和早秋桃結(jié)鈴比例較少，早伏桃相對比例就會增加，造成抗蟲棉早衰。

三、轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的發(fā)展趨勢

1.增強(qiáng)抗蟲基因的抗性，減緩昆蟲的耐受性。

（1）優(yōu)化并聯(lián)合使用多價基因。

對天然抗蟲基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造，在一定程度上能提高對昆蟲的抗性。田穎川等采用定點(diǎn)突變法對雪花蓮凝集素（GNA）進(jìn)行了遺傳修飾，將其含有的稀有密碼子改造成植物常用密碼子，修飾后的GNA轉(zhuǎn)基因棉花與對照相比對棉蚜有很好的抑制作用。

（2）RNAi技術(shù)。

近來，有研究報道，RNAi技術(shù)對控制蘋果淺褐卷葉蛾、吸血椿象、白蟻等多種農(nóng)業(yè)害蟲有很好的效果。目前，利用RNAi技術(shù)防治害蟲還處在試驗(yàn)階段，但利用RNAi技術(shù)防治害蟲將是值得探討的一條路。

（3）“高劑量或庇護(hù)所”（high dose/refuge）策略。

高劑量或庇護(hù)所是將轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物混種，種植的轉(zhuǎn)基因植物能夠高效表達(dá)抗蟲毒素殺死雜合或純合的抗性害蟲。而敏感害蟲能在非轉(zhuǎn)基因植物（“庇護(hù)所”）上繁殖，這樣通過敏感害蟲與抗性害蟲的隨機(jī)交配可以達(dá)到“稀釋”抗性害蟲的抗性基因。

2.采用誘導(dǎo)型、組織特異性的啟動子提高外源抗蟲基因的表達(dá)量。

組織特異性啟動子，可以使外源抗蟲基因僅在植物的花、生長點(diǎn)、蕾、葉、鈴等特定部位高效表達(dá)，減緩害蟲對外源抗蟲基因產(chǎn)生抗性。損傷誘導(dǎo)型啟動子，當(dāng)害蟲取食植株時，植株受到損傷，該啟動子驅(qū)動外源抗蟲基因表達(dá)，大量合成殺蟲蛋白，在植株受到損傷時殺蟲蛋白在受害部位瞬間大量表達(dá)殺蟲蛋白，能更有效地殺死害蟲。這種啟動子應(yīng)該對害蟲的為害產(chǎn)生高度反應(yīng)，或者正好在害蟲為害前由誘導(dǎo)因子加以調(diào)控，使抗蟲基因只有在受到害蟲侵襲時，僅在被害蟲侵襲部位高效表達(dá)。這在一定程度上可以降低對害蟲的選擇壓力，延緩轉(zhuǎn)基因作物的抗性壽命。目前，國內(nèi)外對啟動子的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，應(yīng)不斷探索更多用于抗蟲基因的特異啟動子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的表達(dá)效果。利用時間和空間特異性啟動子，確保外源殺蟲蛋白在特定時間和空間條件下表達(dá)。當(dāng)害蟲危害棉花時，棉花植株受到傷害，誘導(dǎo)啟動子高效表達(dá)，合成外源殺蟲蛋白，在損傷部位瞬間高效表達(dá)，從而更有效地防治害蟲。

3.標(biāo)記基因的安全性策略。

為了避免標(biāo)記基因帶來的安全性問題，近年來在標(biāo)記基因的使用和選擇方面有了新的進(jìn)展。

例如，無選擇標(biāo)記基因的安全技術(shù)，該技術(shù)是利用分離剔除和重組剔除等方法將選擇標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物后代剔除。目前該技術(shù)已在擬南芥、煙草、玉米、水稻等作物中獲得了成功。將該技術(shù)應(yīng)用于煙草，可使外源基因的刪除效率達(dá)100%，但該技術(shù)在大田條件下是否有如此高的刪除效率有待進(jìn)一步的驗(yàn)證[46-47]。而將該技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因棉花生產(chǎn)中將是未來幾年需要解決的問題。此外，開發(fā)新的安全標(biāo)記基因，例如綠色熒光蛋白基因（gfp）[48]、葉綠素生物合成酶基因（HemL）[49]、葡萄糖苷酶基因（gus）、異戊稀轉(zhuǎn)移酶基因（Ipt）[50]等，這些基因不產(chǎn)生抗生素和除草劑抗性，避免了標(biāo)記基因引起的轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題。

4.進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因棉花的產(chǎn)量。

Bt轉(zhuǎn)基因棉花能夠殺死害蟲，但無法提高棉花的產(chǎn)量。我國于2005年成功地選育出了三系雜交抗蟲棉新品種“銀棉2號”，這是我國第一個通過國家審定的比常規(guī)育種抗蟲棉增產(chǎn)26.4%的新品種。并且同時培育了轉(zhuǎn)抗蟲基因三系雜交棉常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合的一種新體系，該體系不僅實(shí)現(xiàn)了棉花的高產(chǎn)、高效，而且成本低。因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲雜交棉對于實(shí)現(xiàn)棉花的高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)具有重要意義。

四、展望

綜上所述，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉不僅在害蟲防治方面起到了一定的作用，還避免了化學(xué)殺蟲劑對環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的破壞，但是目前應(yīng)用于生產(chǎn)中的抗蟲棉大多數(shù)仍是Bt棉，隨之而來也產(chǎn)生了一些新的問題，例如：抗蟲范圍狹窄、害蟲易產(chǎn)生抗性、一些次要害蟲轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕οx等。許多工作正致力于研究其新型抗蟲基因、特異性啟動子等，為培育出優(yōu)質(zhì)廣譜性，抗性更持久的抗蟲棉奠定基礎(chǔ)，但關(guān)于一些抗蟲基因的殺蟲機(jī)理、對人畜、天敵有無毒性等目前還不是很清楚，因此，深入研究并培育出持久性雙價抗蟲棉或既抗鱗翅目又抗同翅目害蟲的多價抗蟲棉，且品質(zhì)優(yōu)良，高產(chǎn)早熟的新品種，是抗蟲棉的發(fā)展趨勢。而開發(fā)新的標(biāo)記基因，提高轉(zhuǎn)基因棉的安全性也是今后應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)內(nèi)容。

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