王永祥，張本忠，吳 聰，李豪杰，何文華，高小玲

(1.蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，蘭州 730000)

據(jù)WHO估計(jì)，全球約有1/3的人口是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染患者，其中有5%～10%的人會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性肺結(jié)核[1-2]。潛伏期結(jié)核分枝桿菌存在于肉芽腫組織中，這是一種低氧、高一氧化氮、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的微環(huán)境[3]。結(jié)核分枝桿菌在此環(huán)境中處于休眠期，生長(zhǎng)速度非常緩慢，也正是因?yàn)槿绱耍Y(jié)核分枝桿菌逃避了機(jī)體免疫系統(tǒng)的作用，從而存活下來[4-5]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌基因組存在著一組包含48個(gè)基因的休眠存活調(diào)節(jié)子(DosR),這48個(gè)基因編碼的蛋白控制著結(jié)核潛伏期的生理過程[6]。肉芽腫組織中的結(jié)核分枝桿菌存在著依賴氧壓的細(xì)胞和生化動(dòng)力學(xué)機(jī)制，能夠使其快速適應(yīng)微環(huán)境改變的能力，在此過程中結(jié)核分枝桿菌DsoR基因起著至關(guān)重要的作用[7-8]。與活動(dòng)期結(jié)核分枝桿菌相比，DosR區(qū)域編碼的抗原能夠引起潛伏期結(jié)核患者產(chǎn)生更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)[9]，這表明DosR基因很可能在潛伏期特異性表達(dá)。有研究報(bào)道，DosR基因編碼的許多蛋白有助于結(jié)核分枝桿菌利用其他碳源途徑獲得能量，如乙醛酸代謝、硝基還原和脂肪酸代謝等[10-11]。探索DosR基因生物學(xué)功能有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)結(jié)核分枝桿菌潛伏期的生理調(diào)控過程，從而有針對(duì)性地進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的目的，對(duì)于預(yù)防活動(dòng)性結(jié)核的發(fā)生至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)試劑結(jié)核分枝桿菌H37Rv株，載體pET30a由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自南京諾唯贊公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天恩澤公司；膠回收試劑盒購自Zymo公司；各種限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；DNA聚合酶和連接酶購自TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司。美國(guó)Biorad酶標(biāo)儀。

1.2方法

1.2.1結(jié)核分枝桿菌DNA的提取 結(jié)核分枝桿菌DNA的提取依據(jù)已報(bào)道的文獻(xiàn)進(jìn)行[12]。具體方法如下： 挑取結(jié)核分枝桿菌菌落，置于裝有200 μL生理鹽水的1.5 mL離心管中，80 ℃煮沸滅活30 min，12 000 r/min離心15 min后，加入蛋白酶K和溶菌酶充分裂解結(jié)核分枝桿菌，然后用酚-氯仿抽提法獲取結(jié)核分枝桿菌基因組，無水乙醇沉淀雙鏈DNA，干燥后TE緩沖液(50 μL)溶解DNA。

1.2.2引物設(shè)計(jì) 在DBGET數(shù)據(jù)庫中查找結(jié)核基因Rv2029c的全基因序列，然后采用Primer5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)Rv2029c特異性引物序列，上下游分別插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的引物序列為上游引物Rv2029F：CGG AAT CCA TGA CGG AGC CAG CGG CGT，其中CG是保護(hù)性堿基，GAA TCC是EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物Rv2029R：CCC AAG CTT TCA TGG CGA GGC TTC CGG GTT，其中CCC是保護(hù)性堿基，AAGCTT是HindⅢ酶切位點(diǎn)。

1.2.3純化目的基因 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的方法對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：98 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，72 ℃延伸80 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后的目的基因利用膠回收試劑盒(美國(guó)Zymo公司膠回收試劑盒，D4007)進(jìn)行純化和濃縮。具體方法如下：首先在瓊脂糖凝膠上準(zhǔn)確切取目的基因片段，然后加入凝膠溶解液，37～55 ℃孵育融化5～10 min后，過柱離心吸附，加Washing buffer洗滌2次后，用10～20 μLTE緩沖液洗脫即可。

1.2.4重組質(zhì)粒的構(gòu)建 重組質(zhì)粒PE730a-Rv2029c的構(gòu)建依據(jù)文獻(xiàn)[12]，主要概述如下：用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ對(duì)目的基因和載體pET30a進(jìn)行雙酶切，然后經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收。目的基因和載體按3∶1的比例，在DNA連接酶的作用下，16 ℃過夜連接。連接后的目的基因，導(dǎo)入到大腸埃希菌感受態(tài)(BL21)細(xì)胞中，4 ℃水浴30 min后，42 ℃準(zhǔn)確熱激45 s后，加入無抗菌藥物的LB培養(yǎng)液后，細(xì)菌復(fù)蘇45 min，然后將細(xì)菌均勻涂到含卡那霉素(50 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)皿中，37 ℃過夜后挑取陽性單克隆菌落并提取質(zhì)粒(北京天恩澤公司質(zhì)粒提取試劑盒，60205)，雙酶切(EcoRⅠ和HindⅢ)鑒定后送南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c促生長(zhǎng)作用研究 大腸埃希菌BL21是一種常用的基因工程表達(dá)菌株，其生長(zhǎng)分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期和衰亡期。遲緩期大腸埃希菌適應(yīng)新的環(huán)境，因此生長(zhǎng)速度很慢，對(duì)數(shù)期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充分，細(xì)菌呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，大腸埃希菌代謝產(chǎn)物不斷積累，培養(yǎng)基pH逐漸下降，大腸埃希菌生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)菌總數(shù)趨于穩(wěn)定。大腸埃希菌的平臺(tái)期與結(jié)核分枝桿菌的肉芽腫微環(huán)境相似，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)都是一種不利的環(huán)境，以此模擬肉芽腫微環(huán)境，將結(jié)核DosR蛋白導(dǎo)入大腸埃希菌BL21中，觀察對(duì)其生長(zhǎng)有無影響。

取出保存的pET30a大腸埃希菌(空質(zhì)粒組)和pET30a-Rv2029c大腸埃希菌(重組質(zhì)粒組)，在含50 μg/mL卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，記錄吸光度(OD)600值。然后將菌液調(diào)整至相同的OD值并吸取600 μL菌液加至300 mL LB培養(yǎng)基中(含 50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃ 300 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取600 μL菌液，檢測(cè)OD值(每次測(cè)3組OD值，每組測(cè)200 μL)。在第5個(gè)小時(shí)當(dāng)2組大腸埃希菌OD值為0.45時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(500 mmol/L),之后繼續(xù)每隔1 h取600 μL菌液測(cè)OD值，如此連續(xù)重復(fù)測(cè)量15 h。在相同條件(相同菌種，相同生長(zhǎng)和測(cè)量條件)下重復(fù)該實(shí)驗(yàn)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0對(duì)1.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定量數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)量的方差分析及t檢驗(yàn)，比較空質(zhì)粒組與重組質(zhì)粒組對(duì)大腸埃希菌OD值是否產(chǎn)生影響，并作出生長(zhǎng)曲線圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1Rv2029c基因擴(kuò)增結(jié)果 以提取的結(jié)核基因組為模板，在設(shè)計(jì)好的引物作用下，行PCR擴(kuò)增。PCR成功擴(kuò)出Rv2029c DNA，大小1 020 bp。見圖1。

注：1為基因Rv2029c；M為DNA2000標(biāo)記物

圖1結(jié)核DosR基因Rv2029c PCR結(jié)果

2.2pET30a-Rv2029c重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將挑取的單克隆菌用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，陽性重組質(zhì)粒能切出2條基因片段，分別為質(zhì)粒pET30a(5 422 bp)和插入的目的基因Rv2029c(1 020 bp)。與連接片段大小吻合，可初步認(rèn)為pET30a-Rv2029c構(gòu)建成功。見圖2。

注：M為DNA標(biāo)記物；1～2為陰性質(zhì)粒；3為陽性質(zhì)粒pET30a-Rv2029c

圖2 pET30a-Rv2029c重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

2.3基因測(cè)序結(jié)果和GenBank序列比對(duì) 將酶切鑒定成功的重組質(zhì)粒送往南京金斯瑞公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank所給序列進(jìn)行Blast。基因Rv2029c與GenBank中所給序列完全吻合，重復(fù)率100%，基因無突變。

2.4pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將3次測(cè)量獲得的資料進(jìn)行重復(fù)測(cè)量的方差分析，結(jié)果顯示sum值觀察時(shí)間效應(yīng)：不同時(shí)間OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8 351.248，P<0.05)，空質(zhì)粒組(pET30a)和重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)不同時(shí)間OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3 593.681、4 125.791，P<0.05)。sum值觀察處理因素效應(yīng),重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)OD值高于空質(zhì)粒組(pET30a)(t=4 416.54，P<0.05)。從各時(shí)間點(diǎn)來看，0～5 h空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.372、1.220、0.894、0.935、0.787、0.395，P>0.05)，6～15 h由于加入IPTG誘導(dǎo)了蛋白R(shí)v2029c的表達(dá)，OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生長(zhǎng)時(shí)間和處理因素存在交互效應(yīng)(F=767.049，P<0.05)。見表1。

表1 0～15 h導(dǎo)入Rv2029c對(duì)大腸埃希菌OD值的影響

組別生長(zhǎng)時(shí)間(h)101112131415sumFP空質(zhì)粒組x0.605 0.608 0.616 0.610 0.608 0.618 0.411 3 593.6810.000 s0.018 0.007 0.010 0.011 0.014 0.011 0.272 重組質(zhì)粒組x1.015 1.057 1.097 1.103 1.164 1.159 0.658 4 125.7910.000 s0.023 0.017 0.027 0.026 0.056 0.022 0.476 sumx0.809 0.832 0.856 0.856 0.885 0.889 0.534 *8 351.248* 0.000*s0.212 0.231 0.248 0.254 0.289 0.279 0.371 *t42.664 70.736 49.077 51.358 28.815 66.182 4 416.540* P0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 *

2.5pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長(zhǎng)曲線 以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出大腸埃希菌生長(zhǎng)曲線見圖3。在5 h時(shí)(此時(shí)OD值約為0.45)加入IPTG，空質(zhì)粒組(pET30a)大腸埃希菌在6 h進(jìn)入平臺(tái)期，而重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)卻能繼續(xù)維持對(duì)數(shù)期達(dá)10 h左右，并且突破大腸埃希菌的生長(zhǎng)界限，使大腸埃希菌的OD值達(dá)到1.16左右才進(jìn)入平臺(tái)期，若以O(shè)D值反映大腸埃希菌數(shù)量，則重組質(zhì)粒(pET30a-Rv2029c)能促使大腸埃希菌生長(zhǎng)量提高1倍。

圖3 蛋白R(shí)v2029c促大腸埃希菌生長(zhǎng)曲線

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌與不導(dǎo)入該基因的大腸埃希菌相比，存在著某種機(jī)制使大腸埃希菌能夠在低氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏的環(huán)境下繼續(xù)維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，增強(qiáng)了大腸埃希菌抵抗應(yīng)激環(huán)境的能力，增加了大腸埃希菌的數(shù)量。Rv2029c蛋白在Mg2+和ATP的參與下催化6磷酸果糖形成2,6二磷酸果糖，因此在糖代謝中起著重要作用。含有重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌可能通過Rv2029c蛋白，調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給，提高了對(duì)抗低氧環(huán)境，增加了利用糖酵解的能力，與不含Rv2029c的大腸埃希菌相比突破了糖代謝和糖利用的上限，促進(jìn)了大腸埃希菌的生長(zhǎng)。

結(jié)核分枝桿菌的肉芽腫環(huán)境同大腸埃希菌平臺(tái)期環(huán)境相似，都存在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、低氧、代謝產(chǎn)物增加等對(duì)細(xì)菌生存不利的因素，依此推斷，結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)v2029c可能在肉芽腫環(huán)境組織中起到重要的維持細(xì)菌存活的作用。結(jié)核分枝桿菌在潛伏期為適應(yīng)肉芽腫的微環(huán)境，一方面需要減少自身代謝活動(dòng)從而進(jìn)入休眠期，KUMAR等[13]對(duì)DosR蛋白中的Rv0079(休眠相關(guān)翻譯抑制子DATIN) 的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此蛋白抑制了大腸埃希菌的生長(zhǎng)，這是因?yàn)樵摰鞍着c核糖體30S亞基結(jié)合從而阻斷了蛋白合成中的翻譯過程，降低了細(xì)菌的繁殖速度，使其進(jìn)入休眠期。另一方面結(jié)核分枝桿菌可能需要最大限度利用環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等滿足自身生存基本需要，本文研究的結(jié)果支持了這一點(diǎn)，生物信息學(xué)分析表明蛋白R(shí)v2029c為6-磷酸果糖激酶2，此蛋白屬于pfkB糖激酶超家族，是糖代謝的一種重要信號(hào)酶，通過影響2，6二磷酸果糖的水平實(shí)現(xiàn)對(duì)糖酵解通路的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌在肉芽腫環(huán)境中最大程度利用氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力，維持結(jié)核分枝桿菌生存基本需求。進(jìn)一步研究該蛋白促進(jìn)細(xì)菌糖酵解的具體機(jī)制是下一步研究的方向。