常慧萍，夏鐵騎，付瑞敏，楊 雪，邢文會(huì)，韓鴻鵬，張 紅

(1.河南教育學(xué)院生命科學(xué)系，河南鄭州 450046； 2.濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽 457000)

氮、磷、鉀是植物生長發(fā)育過程中必需的3種礦質(zhì)元素，被稱作“肥料三要素”。提高土壤磷素和磷肥的利用效率、開發(fā)磷肥資源潛能是節(jié)約磷肥的重要措施，對我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。土壤中含量豐富的磷元素95%以上與土壤中的Fe3+、Ca2+、Al3+等結(jié)合，以難溶性的磷酸鈣鹽形式存在而喪失其有效性，導(dǎo)致我國2/3的耕地缺磷[1-2]。為解決土壤缺磷問題，提高作物產(chǎn)量，每年須向土壤中施入大量可溶性化學(xué)磷肥，但長期過量使用帶來了環(huán)境污染、土壤板結(jié)、地力衰退、生態(tài)惡化和農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降等問題[3]。生產(chǎn)實(shí)踐證明，微生物肥料在提升耕地土壤肥力、維持耕地土壤結(jié)構(gòu)、保持耕地土壤健康、降低耕地土壤污染、提高耕地農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)上效果顯著，在國家耕地質(zhì)量提升的需求中具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。

解磷微生物是能將土壤中難溶性化合態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的特殊微生物功能類群，在轉(zhuǎn)化土壤難溶性磷、提高土壤中有效磷含量、磷肥利用率及促進(jìn)作物生長等方面具有顯著作用[5-6]。某些植物根際促生細(xì)菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)可分泌有機(jī)酸溶解難溶性無機(jī)磷酸鹽，或分泌胞外磷酸酶將難溶性的磷酸脂等有機(jī)磷消解，釋放出生物有效磷，提高土壤中可溶性磷的含量，促進(jìn)植物生長[1]。史發(fā)超等篩選了1株可溶解難溶性磷的菌株P(guān)83斜臥青霉菌(Penicilliumdecumbens)，能顯著增加土壤有效磷水平，對玉米生長和增產(chǎn)具有顯著作用[6]；姜瑛等分離了1株貪噬菌屬(Variovoraxsp.)的固氮解磷菌JX14，顯著促進(jìn)了花生的生長及其全氮、全磷、全鉀含量的提高[8]；張?jiān)葡嫉确蛛x了1株高效解磷的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)JT-1，提高了磷肥利用率10.79%，促進(jìn)小麥增產(chǎn)12.3%[9]。根際微生物研究的最終目標(biāo)是充分利用根際微生物資源，促進(jìn)植物生長、保持植物健康、減少農(nóng)用化學(xué)品的投入，從而促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[10]。本研究根據(jù)PGPR的促生長指標(biāo)如產(chǎn)生植物生長素、產(chǎn)生HCN、產(chǎn)生鐵載體、溶磷、拮抗病原菌篩選小麥根際優(yōu)良的解磷菌，通過小麥的Hoagland半固體培養(yǎng)基栽培試驗(yàn)，評估解磷菌劑對小麥生長的影響，以期為小麥高效解磷微生物肥料研究與開發(fā)提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥種子為新麥26，土壤樣品采自鄭東新區(qū)小麥田，深度為0～20 cm根系及土壤，保存于無菌紙袋中。

1.2 培養(yǎng)基、試劑

所用培養(yǎng)基、試劑包括LB培養(yǎng)基與PDA培養(yǎng)基[11]、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基與PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基[12]、MM培養(yǎng)基[13]、NB培養(yǎng)基(牛肉浸膏3 g、酵母粉1 g、蛋白胨5 g、蔗糖10 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH值7.2)、CAS檢測培養(yǎng)基[14-15]、Hoagland半固體培養(yǎng)基和磷酸鹽(PBS)緩沖液[16]、蛋白胨水(蛋白胨10 g、氯化鈉 5 g、蒸餾水1 L，pH值7.8)。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品稀釋液的制備 將小麥根系剪為約3 cm的根段并混合，稱取10 g置于含有無菌水的三角瓶中充分振蕩，得到小麥根際土壤懸液，將懸液稀釋為10-1～10-6梯度稀釋液。

1.3.2 小麥根際解磷菌的初篩 分別取10-3～10-6稀釋液均勻涂布到PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上，初篩具有解磷能力的菌株。28 ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取溶磷圈直徑/菌落直徑(D/d)較大的單菌落，多次繼代培養(yǎng)，選取長勢旺盛的菌株。

1.3.3 小麥根際解磷菌的復(fù)篩

1.3.3.1 產(chǎn)生長素(IAA)的測定[17]稱取分析純吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，用蒸餾水配制濃度分別為10、20、30、40、50、60、80、100 mg/L的IAA溶液，在530 nm下測定各溶液的D530 nm，繪制IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將初篩解磷菌接種于MM液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)12 d，離心得上清液。取1 mL上清液加入2 mL Salkowski’s反應(yīng)液(1 L 10.8 mol/L H2SO4中含4.5 g的FeCl3)，暗處25 ℃混合反應(yīng)30 min。測定混合反應(yīng)液D530 nm，空白培養(yǎng)基作為對照。根據(jù)IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算初篩菌株IAA產(chǎn)生量(mg/L)。

1.3.3.2 產(chǎn)鐵載體檢測[14，16]將初篩解磷菌于LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)期，按三點(diǎn)接種法點(diǎn)接在CAS固體檢測平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d。根據(jù)菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的橙色暈圈，判斷菌株產(chǎn)鐵載體的能力。

1.3.3.3 產(chǎn)HCN能力測定 滅菌后NB培養(yǎng)基中添加甘氨酸(濃度為4.4 g/L)，劃線接種初篩菌株，并把浸過2%碳酸鈉、0.5% 2，4，6-三硝基苯酚溶液的濾紙平鋪于平板上，28 ℃ 培養(yǎng)4 d，根據(jù)濾紙顏色變化(橘黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色)判斷菌株產(chǎn)HCN的能力。

1.3.3.4 解磷性能的測定[15，18]將初篩解磷菌接種到液體PKO培養(yǎng)基(或蒙金娜培養(yǎng)基)上，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) 4～5 d，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，鉬銻抗比色法測定有效磷含量。

1.3.3.5 產(chǎn)NH3能力測定 將初篩解磷菌接種到含蛋白胨水的試管中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，加入0.5 mL Nessler’s試劑，根據(jù)蛋白胨水顏色變化(由褐色變?yōu)辄S色)判斷菌株產(chǎn)生NH3的能力。

1.3.3.6 與病原真菌拮抗作用的測定[19]初篩菌株與病原菌拮抗作用的測定采用平板對峙法。PDA平板接種小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、水稻紋枯病菌(R.solani)，25 ℃培養(yǎng)5～7 d獲得病原菌菌餅，LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)初篩解磷菌48 h獲得菌懸液。將病原菌與初篩菌株同時(shí)接種PDA平板：平板中心接種病原菌菌餅(直徑為5～6 mm)，距中心約3 cm處滴加初篩菌株懸液。25 ℃培養(yǎng)3～5 d，記錄病原菌的菌落半徑(R)、病原菌點(diǎn)樣中心點(diǎn)到被初篩菌株抑制的邊緣的半徑(r)，計(jì)算抑制率：抑制率=(R-r)/R×100%。

1.3.4 解磷菌株的鑒定 依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對解磷菌HP1218的形態(tài)特征及生理生化特性進(jìn)行研究。提取HP1218的總DNA，分析其16S rDNA基因序列。PCR擴(kuò)增上游引物8f序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′，下游引物1541r序列為5′-AAGGAGGTGATCCANCC RCA-3′，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應(yīng)。純化獲得的PCR產(chǎn)物由微基生物科技(上海)有限公司進(jìn)行測序。將16 S rDNA基因序列通過BLAST程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，使用MEGA 6.0軟件對菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(Neighbour-Joining，簡稱NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.5 解磷菌株對小麥幼苗生長的影響[20]選取飽滿、健壯的小麥種子進(jìn)行表面消毒，并于25 ℃暗處萌發(fā)2 d。設(shè)置2個(gè)處理：接菌處理(HP1218)，將解磷菌HP1218的培養(yǎng)液用PBS緩沖液洗滌并稀釋至1×108CFU/mL左右，萌發(fā)種子浸入稀釋菌液中吸附1 h；對照處理(CK)，萌發(fā)種子浸泡在PBS緩沖液中1 h。將2種不同處理的小麥種子分別播種于Hoagland半固體培養(yǎng)基中，人工智能培養(yǎng)箱中(25 ℃，14 h光照/10 h黑暗，40%～50%相對濕度)培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)后10 d統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)的根數(shù)，并測定幼苗的根長與株高。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌株的初篩

在PKO無機(jī)磷培養(yǎng)基、蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基上分別涂布小麥根際土壤稀釋液，28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，挑取有溶磷圈的解無機(jī)磷細(xì)菌12株，解有機(jī)磷細(xì)菌12株，經(jīng)多次繼代，最終選取長勢較好、D/d較大的解無機(jī)磷細(xì)菌4株，解有機(jī)磷細(xì)菌4株。

2.2 解磷菌株的復(fù)篩

對初篩的4株解無機(jī)磷細(xì)菌、4株解有機(jī)磷細(xì)菌進(jìn)行生長性能的測定，結(jié)果見表1。根據(jù)菌株產(chǎn)IAA能力、溶磷能力，且具有產(chǎn)HCN、NH3或者產(chǎn)鐵載體的能力，篩選出HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株，與病原菌的進(jìn)行拮抗試驗(yàn)。

表1 菌株的促生長性能

將HP1218、HP1220、HP1223、HP1224菌株分別與小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果見表2。從表2可知，對3種病原菌均有抑制能力的菌株為HP1218、HP1223。綜合兩者的促生長特性，篩選HP1218作為解磷菌肥料的功能菌株。

表2 菌株對病原真菌的抑菌率

2.3 解磷菌株的鑒定

由表3可知，菌株HP1218呈短桿狀、革蘭氏陰性菌，不產(chǎn)芽孢，具有運(yùn)動(dòng)性；菌落淡黃色、圓形、濕潤光滑、邊緣整齊；能發(fā)酵葡萄糖，水解淀粉，不液化明膠，吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P反應(yīng)陰性，能夠利用檸檬酸鹽和甘露醇，接觸酶、過氧化氫酶陽性。

表3 解磷菌HP1218的形態(tài)特征及生理生化特性

對菌株HP1218的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖1可知，HP1218與假單胞菌屬成員具有較高的序列相似性，與假單胞菌屬(Pseudomonassp.)菌株H9zhy(AM410625.1)親緣關(guān)系最近，且BLAST比對結(jié)果顯示2株菌的16S rDNA基因序列相似度達(dá)到99%以上。結(jié)合HP1218形態(tài)特征、生理生化特性，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，確定HP1218屬于假單胞菌屬(Pseudomonassp.)細(xì)菌。

2.4 解磷菌對小麥幼苗的促生效果

用PBS緩沖液稀釋HP1218的菌液，小麥種子通過浸種方式接種。從圖2可以看出，HP1218浸種處理萌發(fā)5條根的小麥種子所占比例為35.5%，顯著高于對照(31.6%)；萌發(fā)6條根的小麥種子所占比例為13.5%，顯著高于對照(9.4%)；萌發(fā)3條根和4條根的比例總和由對照59.0%下降為51.0%。由圖3可知，HP1218浸種處理的小麥幼苗平均根長為12.4 cm，較對照增加20.4%；小麥幼苗平均株高為 15.4 cm，較對照增加13.2%。表明菌株HP1218對小麥種子的生根和幼苗生長均有明顯的促進(jìn)作用。

3 討論與結(jié)論

我國74%的耕地缺磷，且土壤中95%以上的磷素呈無效態(tài)，作物對施入的磷肥當(dāng)季利用率僅為5%～25%。由于大部分磷素與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等結(jié)合形成難溶性磷酸鹽，導(dǎo)致土壤磷素快速積累，有效磷缺乏。具有解磷能力的植物根際促生細(xì)菌，能夠礦化難溶性磷酸鹽，為植物可吸收利用的可溶性磷，這些PGPR菌株可作為生產(chǎn)微生物肥料的潛在菌株。目前報(bào)道的解磷細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌菌屬、固氮菌屬(Azotobacter)等；解磷真菌主要是青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和根霉屬(Rhizopus)；解磷放線菌多為鏈霉菌屬(Streptomyces)。史國英等從甘蔗根際土壤中篩選到1株具有較強(qiáng)解無機(jī)磷能力的洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)BS06，研究表明BS06能顯著促進(jìn)甘蔗組培苗的生長并提高甘蔗植株的含磷量[21]。Babana等研究了大田條件下解磷微生物對小麥的促生效果，出苗5 d后小麥的根干質(zhì)量增加128%[22]。陳丹陽等篩選到1株鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)的解磷菌，利用薄層層析法分析其產(chǎn)生的有機(jī)酸，并研究其解磷機(jī)理[23]。Hariprasad等對16株解磷菌在溫室條件下進(jìn)行了番茄接種試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)處理植株的根長、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和番茄的磷含量均有不同程度的提高[24]；邢芳芳等篩選了1株具有溶磷作用的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)PSM，盆栽試驗(yàn)表明，PSM解磷菌顯著提高白菜的葉綠素、生物產(chǎn)量和葉片數(shù)，對白菜的促生作用明顯[25]。本研究根據(jù)菌株產(chǎn)IAA、NH3、HCN、鐵載體的能力、溶磷能力以及拮抗病原菌的作用，從小麥根際篩選出解磷菌HP1218，具有產(chǎn)NH3和鐵載體的能力，發(fā)酵液中IAA含量可達(dá)到 54.21 mg/mL，有效磷含量為35.39 mg/L，且對小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌3種病原菌均有拮抗能力。經(jīng)鑒定，解磷菌HP1218屬于假單胞菌屬細(xì)菌。菌株HP1218浸種接種的小麥幼苗萌發(fā)5、6條根的比例分別比空白對照增加31.6%、9.4%；平均根長較空白對照增加20.4%，平均株高較空白對照增加13.2%。結(jié)果表明，解磷菌HP1218對小麥種子的生根和幼苗生長均有明顯的促進(jìn)作用，可作為解磷微生物肥料開發(fā)的功能菌株。