郭玉潔，楊會(huì)娟，曹 宇，劉冬云，2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與旅游學(xué)院，河北保定 071000； 2.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071000)

山丹(Liliumpumilum)花色紅艷，觀賞價(jià)值高，且具有很強(qiáng)的抗寒性和抗鐮刀菌性，是優(yōu)良的野生花卉，在近代百合雜交育種中起到重要作用[1]。20世紀(jì)初，俄羅斯就利用西伯利亞寒帶地區(qū)分布的山丹進(jìn)行百合的耐寒性育種工作，培育了大量耐低溫的百合新品種。楊利平等也曾以山丹為親本，進(jìn)行耐寒性百合品種的培育[2-3]。本研究選用山丹與其他百合種或品種進(jìn)行雜交，并利用熒光觀察法[4-6]對(duì)其雜交后的花粉生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，為探討山丹資源在百合遠(yuǎn)緣雜交中的充分利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為山丹；野生種有斑百合(L.concolorvar.buschianum)；栽培種蘭州百合(L.davidiivar.Unicolor)；切花品種東方百合雜種系列的西伯利亞(Seberia)和索邦(Sorbonne)，亞洲百合雜種系列的精粹(Elite)、托里諾(Torino)，以及麝香百合雜種系列的白天堂(White Heaven)。試驗(yàn)于2017年春天在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 雜交組合及授粉方法 均以山丹為親本，分別與其他百合進(jìn)行正反交(組合見表1)。授粉前的準(zhǔn)備及去雄工作參照羅建讓的方法[7]。每個(gè)組合均采用母本花朵開放當(dāng)天授粉、延遲授粉(3～4 d)、連續(xù)多次授粉、子房基部涂抹萘乙酸(NAA，濃度為0.05%、0.1%)、切割花柱授粉(分不使用NAA和使用0.05% NAA 2個(gè)處理)等幾種不同授粉處理。每處理個(gè)數(shù)見結(jié)果分析中相應(yīng)各表。每處理授粉后做好標(biāo)注，約7 d后除去鋁箔紙。統(tǒng)計(jì)各處理的坐果率和有胚率。

1.2.2 花粉萌發(fā)及生長(zhǎng)情況熒光觀察 選取山丹的自交組合處理，以及山丹與有斑百合、索邦、西伯利亞的正反雜交處理后的花柱在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。花柱及子房的采集、固定、透明軟化及染色參照李守麗等的方法[8-9]且有所改動(dòng)，采集時(shí)間為授粉后的1、4、8、12、16、24、36、48、72 h。采用美國(guó)Lecia DM4000 B熒光顯微鏡觀察。每處理采集10個(gè)樣品，試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 常規(guī)授粉對(duì)百合雜交結(jié)實(shí)的影響 當(dāng)天授粉和延遲授粉是雜交授粉的2種常規(guī)方法。由表1可知，以山丹為母本時(shí)，當(dāng)天授粉中坐果率最低是山丹×白天堂，為0，最高是山丹×有斑百合，為58.2%；延遲授粉中山丹×索邦有一定的坐果率，但有胚種子率為0，山丹×西伯利亞坐果率最高，為 53.3%；與當(dāng)天授粉相比，延遲授粉對(duì)大部分雜交組合的坐果率有明顯提高(山丹×有斑百合組合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂組合，坐果率由0增至30.0%，有胚種子率增至57.5%。種子有胚率則均是以山丹×西伯利亞組合最高，正交時(shí)達(dá)到78.6%，反交時(shí)則為80.2%。

以山丹為父本時(shí)，當(dāng)天授粉的雜交組合中，有斑百合×山丹的坐果率為20.0%，有胚種子率為12.5%，精粹×山丹的坐果率最高，但其有胚種子率為0；延遲授粉組合中，白天堂×山丹組合的坐果率為20%，種子有胚率最高，達(dá)到了68.5%。山丹與蘭州百合、西伯利亞和索邦無論當(dāng)天授粉還是延遲授粉，坐果率均為0；與當(dāng)天授粉相比，延遲授粉對(duì)大部分雜交組合的坐果率和有胚種子率有提高作用。

表1 不同百合雜交組合常規(guī)授粉結(jié)實(shí)情況

注：A表示有斑百合；B表示蘭州百合；C表示西伯利亞；D表示索邦；E表示白天堂；F表示精粹；G表示托里諾。下表同。

2.1.2 NAA對(duì)百合雜交結(jié)實(shí)的影響 萘乙酸具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大、增加坐果的作用[10]。NAA的濃度對(duì)百合的組合雜交結(jié)實(shí)有一定的影響，結(jié)果見表2。本研究曾在預(yù)備試驗(yàn)階段采用0.2%NAA處理母本花朵子房基部，卻使大多數(shù)子房變黑，說明選擇的NAA濃度過高。與常規(guī)雜交當(dāng)天授粉相比，以山丹為母本時(shí)，施用0.05% NAA后，除西伯利亞外，其他幾個(gè)雜交組合的坐果率均有提高，但有胚種子率卻差別不大；施用0.1%NAA時(shí)差異最大的是山丹×白天堂組合，不僅坐果率有一定提高，而且有胚種子率達(dá)到了45.3%，其他組合反而下降。以山丹為父本時(shí)，施用0.1%NAA時(shí)，僅有斑百合×山丹的有胚種子率有一定提高，其他無變化，但精粹×山丹的坐果率反而下降。

2.1.3 切割花柱授粉結(jié)實(shí)情況分析 因?yàn)椴煌俸匣ㄖ拈L(zhǎng)短不同，雜交時(shí)常常會(huì)由于短花柱父本因其花粉管長(zhǎng)度不夠而導(dǎo)致雜交不親和，切割花柱是克服這一障礙的有效方法[11-12]。由表3可以看出切割花柱授粉與常規(guī)授粉的差異，以山丹為父本，分別以白天堂、精粹、托里諾為母本的幾個(gè)組合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里諾為母本的坐果率比延遲授粉時(shí)提高了56.2%，切割花柱同時(shí)施用 0.05% NAA，坐果率達(dá)到了90.0%。但除了以白天堂為母本得到的種子有胚外，其他雜交種子均無胚。

2.2 花粉管萌發(fā)熒光觀察

2.2.1 山丹自交花粉管萌發(fā)熒光觀察 山丹自交授粉后，4 h 時(shí)在柱頭可以看到有少量花粉萌發(fā)(圖1-a)；至8 h后，能看到大量花粉萌發(fā)(圖1-b)。山丹自交24 h時(shí)，已經(jīng)有少量花粉管到達(dá)花柱基部(圖1-c)，并進(jìn)入子房(圖1-d)。48 h時(shí)，圖1-e顯示有大量的花粉管進(jìn)入子房，72 h時(shí)已經(jīng)伸長(zhǎng)至子房基部(圖1-f)。

2.2.2 山丹雜交花粉管萌發(fā)熒光觀察 以山丹和有斑百合互為父母本進(jìn)行雜交授粉后，均有一定的坐果率和有胚種子率(表1)。以有斑百合為父本，將花粉授于山丹柱頭表面后，由圖2-a可以看到，4 h時(shí)已有大量花粉管萌發(fā)；圖2-b顯示，8 h時(shí)已經(jīng)有大量的花粉管到達(dá)花柱的中部；至12 h時(shí)，有少量花粉管伸長(zhǎng)至花柱底部(圖2-c)；24 h時(shí)，子房基部已經(jīng)看到有花粉管(圖2-d)。這與山丹自交48 h時(shí)相比，時(shí)間快了1倍，說明有斑百合的花粉管比山丹的花粉管伸長(zhǎng)速度快。

以山丹為父本，將花粉授于有斑百合柱頭表面后，由圖3-a可以看到，4 h時(shí)幾乎無花粉萌發(fā)；圖3b-3f顯示，花粉8 h時(shí)有少量萌發(fā)，24 h時(shí)已有大量萌發(fā)；12 h時(shí)花粉管還沒有到達(dá)子房上部，24 h時(shí)花粉管到達(dá)花柱基部，48 h時(shí)花粉管已經(jīng)進(jìn)入子房。

表2 NAA處理后的結(jié)實(shí)情況

表3 切割花柱授粉結(jié)實(shí)情況

對(duì)山丹與索邦的正反交組合的熒光觀察顯示，以索邦為父本時(shí)，4 h時(shí)花粉已大量萌發(fā)(圖4-a)，至24 h時(shí)，已看到有花粉管到達(dá)子房與花柱結(jié)合處(圖4-c)；以山丹為父本時(shí)，8 h時(shí)花粉大量萌發(fā)(圖4-b)，但直至72 h時(shí)仍未到達(dá)子房(圖 4-d)。

山丹與西伯利亞的正反交組合，據(jù)熒光觀察，以山丹為父本時(shí)，分別采用當(dāng)天和延遲2種方式授粉。由圖5-a所示，當(dāng)天授粉的花粉在12 h有少量萌發(fā)，但之后一直未觀察到有花粉管繼續(xù)向下生長(zhǎng)的情況。而延遲方法授粉后，4 h時(shí)少量花粉萌發(fā)，12 h時(shí)花粉管已經(jīng)伸長(zhǎng)至花柱9 mm處(圖5-b)，但之后的觀察也沒有發(fā)現(xiàn)再繼續(xù)向下生長(zhǎng)的花粉管(圖 5-c)。

而以西伯利亞為父本時(shí)，無論采用當(dāng)天或是延遲授粉，4 h 時(shí)均觀察到已有花粉大量萌發(fā)(圖5-d)，16 h時(shí)能看到花粉管已經(jīng)伸長(zhǎng)至子房(圖5-e)，24 h時(shí)花粉管已經(jīng)到達(dá)子房底部(圖5-f)。

3 討論與結(jié)論

正反交對(duì)于植物雜交具有重要影響。楊利平等將細(xì)葉百合與雪皇后進(jìn)行正反交，所得的結(jié)實(shí)率呈現(xiàn)差異顯著，表明在正反組合雜交中父母本的不同，雜交的親和性以及結(jié)實(shí)率結(jié)果也不同[3]。張西麗等試驗(yàn)證明正反交對(duì)雜交結(jié)實(shí)結(jié)果有很大影響[13]，錢燦的研究也得到了相同的結(jié)論[14]。孫曉梅等研究表明，母本植物卵細(xì)胞中的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)可能會(huì)通過促進(jìn)或抑制雜交時(shí)受精過程，甚至是合子的發(fā)育過程，從而影響雜交結(jié)果[15]。本試驗(yàn)常規(guī)雜交授粉中，山丹作為母本時(shí)各雜交組合的坐果率較高，山丹作為父本時(shí)，雜交組合多表現(xiàn)為雜交坐果率低甚至為0。延遲授粉對(duì)大部分雜交組合的坐果率有明顯提高(山丹×有斑百合組合的坐果率下降)，尤其是山丹×白天堂組合，坐果率和有胚種子率與當(dāng)天授粉區(qū)別顯著。因此，山丹×有斑百合宜當(dāng)天授粉；山丹與蘭州百合、西伯利亞、索邦、白天堂進(jìn)行雜交時(shí)，宜山丹作母本且延遲授粉；山丹與精粹和托里諾的雜交無結(jié)實(shí)，有待進(jìn)一步探究。

有研究表明，化學(xué)藥劑或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用可提高雜交結(jié)實(shí)率[16-20]。本研究中，與常規(guī)雜交授粉相比，山丹×有斑百合、山丹×蘭州百合施用0.05% NAA坐果率更高，山丹×索邦、山丹×白天堂施用0.1% NAA坐果率更高，山丹×西伯利亞施用藥劑后，坐果率下降。本研究表明，化學(xué)藥劑或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)雜交結(jié)實(shí)率有一定的提高，但其也受雜交組合、雜交親本及藥劑濃度的影響，不同的雜交組合的促進(jìn)作用差異顯著，不同濃度藥劑對(duì)其結(jié)實(shí)率的影響也較大。

本試驗(yàn)主要以山丹為父本，對(duì)其進(jìn)行切割花柱授粉研究。研究表明，與常規(guī)授粉相比，分別以白天堂、精粹、托里諾為母本的幾個(gè)組合的坐果率均有了一定程度的提高。其中，以托里諾為母本切割花柱同時(shí)施用0.05% NAA的坐果率提高尤為顯著。但除了以白天堂為母本得到的種子有胚外，其他雜交種子均無胚。

花朵柱頭分泌的黏性物質(zhì)在促使花粉萌發(fā)的同時(shí)，還可有效地防止花粉由于干燥而死亡[21-23]。經(jīng)觀察，切花百合西伯利亞、索邦及白天堂在花朵開放的第3、第4天，柱頭上明顯分泌出大量黏液，山丹在開放第3天柱頭較剛開放時(shí)濕潤(rùn)，所以延遲授粉對(duì)于山丹×西伯利亞及山丹×白天堂、白天堂×山丹組合是克服雜交不孕、提高坐果率的有效方法。西伯利亞作母本時(shí)，與山丹雜交，無論采用何種措施，均得不到果實(shí)，通過熒光觀察發(fā)現(xiàn)西伯利亞×山丹組合在當(dāng)天授粉后有少量花粉萌發(fā)，但并沒有穿過柱頭進(jìn)入花柱，延遲授粉雖進(jìn)入花柱，但未發(fā)現(xiàn)花粉管繼續(xù)向下生長(zhǎng)。由此推測(cè)可能是柱頭分泌物抑制了花粉管的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，或由于胼胝質(zhì)的不規(guī)則堆積、花粉管末端鈍化等一系列的異常表現(xiàn)導(dǎo)致的[24-26]。