李玉萍，李沁曄，羅鳳霞

(金陵科技學(xué)院園藝學(xué)院，江蘇南京 210038)

宋梅別稱宋錦璇梅，為春蘭梅瓣花的代表品種，花形端莊大方，被列為春蘭四大名種之首，與龍字合稱“國(guó)蘭雙璧”。韓國(guó)桃花為大花蕙蘭與墨蘭雜交獲得的雜交蘭(Cymbidiumhybridum×faberi)，花中型、色艷、清香、雅致，它集大花蕙蘭的花大、色艷、花期長(zhǎng)及國(guó)蘭的幽香、典雅和韻味為一體，具有很高的觀賞價(jià)值和市場(chǎng)前景。但蘭花在自然條件下生長(zhǎng)緩慢，傳統(tǒng)的分株繁殖系數(shù)很低，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外主要通過(guò)組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖育苗[1]。蘭花組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，Morel采用大花惠蘭莖尖，誘導(dǎo)形成原球莖并分化成植株，為蘭花工廠化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[2]。此后，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行蘭花的離體快速繁殖發(fā)展迅速?？追昌埖冗M(jìn)行了春蘭離體根狀莖生長(zhǎng)和分化的研究[3]，孫玉芬等進(jìn)行了春蘭與大花蕙蘭雜交后代根狀莖增殖與分化條件的研究[4]，王豐妍等進(jìn)行了大花蕙蘭與春劍雜交原球莖增殖及分化研究[5]，陳蘭芬等進(jìn)行了墨蘭組織培養(yǎng)技術(shù)研究[6]，李玉萍等開(kāi)展了春蘭與大花蕙蘭雜交種原球莖增殖的研究[7]，石樂(lè)娟等進(jìn)行了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)線藝春蘭根狀莖的增殖與分化的研究[8]，潘銀萍等對(duì)春荷鼎雜交根狀莖進(jìn)行了組培快繁[9]。本試驗(yàn)以宋梅與韓國(guó)桃花雜交種子無(wú)菌萌發(fā)獲得的幼苗為材料，探討了不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、有機(jī)質(zhì)及其濃度對(duì)壯苗及生根的影響，以期找出最適合的培養(yǎng)基，為蘭花組培苗的工廠化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交無(wú)菌萌發(fā)種子形成的幼苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度 以改良N6為基本培養(yǎng)基，加入不同濃度的細(xì)胞分裂素BA、生長(zhǎng)素NAA和IBA，設(shè)計(jì)3因子3水平L9(34)的正交試驗(yàn)(表1)。

表1 雜交蘭瓶苗壯苗生根培養(yǎng)基因素及水平

1.2.2 有機(jī)質(zhì)和活性炭 在確定了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其濃度的基礎(chǔ)上，對(duì)香蕉泥、水解乳蛋白(CH)和活性炭(AC)設(shè)計(jì)3因子3水平L9(34)正交試驗(yàn)，探討適宜的有機(jī)質(zhì)及其濃度(表2)。無(wú)香蕉泥的培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂，75 g/L香蕉泥的培養(yǎng)基中加入8 g/L瓊脂，150 g/L香蕉泥的培養(yǎng)基中加入 9 g/L 瓊脂。各培養(yǎng)基均添加20 g/L蔗糖、pH值5.8，121 ℃滅菌20 min。

表2 雜交蘭瓶苗壯苗生根培養(yǎng)基組成成分及其水平

1.2.3 接種與培養(yǎng)方法 挑選相同高度的幼苗，切去全部根系，接種到含不同附加物的培養(yǎng)基中，每處理接種10瓶，每瓶接種3株。培養(yǎng)環(huán)境光照12 h/d，光照度1 600～2 000 lx，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其濃度對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

幼苗接種2～3周后開(kāi)始生根，并逐漸伸長(zhǎng)。新根吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，會(huì)明顯促進(jìn)莖葉的生長(zhǎng)。4～5周后幼苗長(zhǎng)出較粗壯的根系，形成完整的植株。接種60 d后，分別調(diào)查各處理接種幼苗的新增芽數(shù)、苗高、根數(shù)、根長(zhǎng)和長(zhǎng)勢(shì)，并進(jìn)行極差分析(表3、表4)。

表3 培養(yǎng)基對(duì)雜交幼苗生長(zhǎng)的影響

表4 培養(yǎng)基對(duì)雜交幼苗生根的影響

2.1.1 雜交幼苗壯苗 研究發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基組成對(duì)新增芽數(shù)和苗高的影響不同(表3)。由極差分析可知，3種不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)平均苗高的影響效應(yīng)分別為BA(2.01)>NAA(1.20)>IBA(0.91)。BA是影響雜交蘭幼苗增高的主要因素，幼苗高度與BA濃度之間呈現(xiàn)正相關(guān)，0.2 mg/L BA對(duì)苗高的影響最大，幼苗平均高度達(dá)到4.82 cm；NAA可抑制幼苗的生長(zhǎng)，隨濃度的升高，幼苗平均高度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)NAA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，幼苗高度比不添加NAA時(shí)下降了1.20 cm；IBA對(duì)幼苗高度變化的影響較小，且各濃度之間苗高的差別較小。因此，從理論上分析試驗(yàn)所選3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度組合為0.2 mg/L BA+1 mg/L IBA，與試驗(yàn)值一致，為9號(hào)培養(yǎng)基，但在該培養(yǎng)基上新增芽數(shù)為0。

對(duì)不同組合的新增芽數(shù)進(jìn)行極差分析，R值大小順序?yàn)镹AA(0.42)>IBA(0.28)>BA(0.27)。由此可知，NAA是影響幼苗新芽增殖的主要因素，但NAA濃度不能過(guò)高，其濃度為0.5 mg/L時(shí)，新增芽數(shù)平均為0.53個(gè)，濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，新增芽數(shù)平均值下降為0.22個(gè)。BA和IBA對(duì)新增芽數(shù)的影響R值相近，但最適應(yīng)濃度不同，BA濃度為0、IBA濃度為0.5 mg/L時(shí)，新增芽數(shù)平均值均表現(xiàn)最大，為0.4個(gè)。理論最佳促進(jìn)新芽萌發(fā)的培養(yǎng)基為0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA，與試驗(yàn)值一致，為2號(hào)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基上幼苗最矮，僅為2.56 cm，與9號(hào)培養(yǎng)基高度相差3.56 cm。由此可知，苗高增長(zhǎng)和新芽增殖適宜的培養(yǎng)基完全不同，生產(chǎn)中可根據(jù)需要選擇合適的培養(yǎng)基。若綜合考慮培養(yǎng)基對(duì)苗高和新增芽數(shù)的影響，培養(yǎng)基7號(hào)和8號(hào)表現(xiàn)適中，平均苗高分別為4.00、4.33 cm，平均新增芽數(shù)為0.60、0.44個(gè)，可作為春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交后代幼苗壯苗的適宜培養(yǎng)基(表3)。

2.1.2 雜交幼苗生根 研究發(fā)現(xiàn)，幼苗在各培養(yǎng)基上均能誘導(dǎo)產(chǎn)生根系，其生長(zhǎng)狀況除4號(hào)培養(yǎng)基較弱外，其他均較好，但在不同的培養(yǎng)基上仍有差異(表4)。平均根數(shù)的R值的大小順序?yàn)镮BA(2.04)>NAA(2.00)>BA(1.68)，IBA是影響生根最主要的因素，其次是NAA。IBA濃度為 0.5 mg/L、NAA濃度為1 mg/L時(shí)對(duì)生根效果較好。理論最佳生根培養(yǎng)基為0.2 mg/LBA+0.5 mg/L IBA+1 mg/L NAA，與試驗(yàn)值一致，為8號(hào)培養(yǎng)基。

平均根長(zhǎng)的R值大小順序?yàn)镹AA(2.11)>IBA(1.31)>BA(0.6)，NAA是主要的影響因素，IBA次之。NAA和BA對(duì)新生根的生長(zhǎng)具有抑制作用，不添加二者時(shí)，平均根長(zhǎng)均最長(zhǎng)，隨濃度的增加均表現(xiàn)出平均根長(zhǎng)變短的趨勢(shì)，分別下降2.11、0.6 cm；IBA則相反，隨濃度的增加，平均根長(zhǎng)不斷增加，濃度為1 mg/L時(shí)比不添加時(shí)多1.31 cm。理論根生長(zhǎng)最佳的培養(yǎng)基只須要添加0.5 mg/L IBA，在試驗(yàn)所配制的9種培養(yǎng)基中沒(méi)有該組合。從試驗(yàn)結(jié)果可知，8號(hào)培養(yǎng)基的平均根長(zhǎng)是最長(zhǎng)的。

綜合考慮植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度對(duì)生根數(shù)和根長(zhǎng)的影響，2號(hào)和9號(hào)培養(yǎng)基在60 d后生根情況較其他培養(yǎng)基更好，根較健壯，因此可以判斷適應(yīng)春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交后代幼苗壯苗生根的適宜培養(yǎng)基為N6+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA或N6+0.2 mg/L BA+1 mg/L IBA。

2.2 有機(jī)質(zhì)和活性炭研究對(duì)雜交苗生長(zhǎng)的影響

接種培養(yǎng)60 d后，分別調(diào)查L(zhǎng)9(34)正交試驗(yàn)9種培養(yǎng)基中的30株苗的新增芽數(shù)、苗高、根數(shù)、根長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)，計(jì)算平均數(shù)并進(jìn)行極差分析(表5、表6)。

2.2.1 雜交幼苗壯苗 研究發(fā)現(xiàn)，不同有機(jī)質(zhì)和活性炭對(duì)雜交幼苗苗高和新增芽數(shù)的影響不同，各組合平均苗高的R值大小順序?yàn)锳C(1.44)>香蕉泥(1.25)>CH(1.03)，AC是影響平均苗高的主要因素、香蕉泥次之(表5)。隨著AC濃度增加，其平均苗高表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，AC濃度為0.5 g/L時(shí)對(duì)幼苗生長(zhǎng)效果最佳。香蕉泥隨濃度的增加，對(duì)幼苗的生長(zhǎng)呈現(xiàn)促進(jìn)作用，濃度為 150 g/L 時(shí)平均苗高達(dá)到4.14 cm。CH對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響最小，3個(gè)濃度梯度間的變化相對(duì)較小，但不加時(shí)平均苗高最大，為 4.29 cm。因此，就雜交苗高度而言，適宜的理論培養(yǎng)基有機(jī)物和活性炭組合為150 g/L香蕉泥+0.5 g/L AC，與試驗(yàn)值相同，為7號(hào)培養(yǎng)基。

表5 有機(jī)質(zhì)和活性炭對(duì)幼苗生長(zhǎng)的影響

表6 有機(jī)質(zhì)和活性炭對(duì)幼苗生根的影響

新增芽數(shù)的R值順序?yàn)镃H(0.33)>香蕉泥(0.17)>AC(0.15)，CH是主要的影響因素，香蕉泥次之。CH濃度過(guò)高或過(guò)低，新增芽數(shù)平均值均低于濃度為0.5 mg/L時(shí)(此時(shí)平均每株可增加0.51個(gè)新芽)。不添加香蕉泥時(shí)，新增芽數(shù)最大，平均值為0.42個(gè)。AC對(duì)新增芽數(shù)的影響是低濃度促進(jìn)、高濃度抑制，濃度為0.5 m/L時(shí)新增芽數(shù)最多，平均為0.44個(gè)。因此，新增芽數(shù)適宜的理論組合為1.0 mg/L CH+0.5 g/L AC，與試驗(yàn)值一致，為2號(hào)培養(yǎng)基。

綜合考慮有機(jī)物和活性炭對(duì)幼苗高度和新芽增殖的影響，上述9種培養(yǎng)基中7號(hào)培養(yǎng)基比較適宜春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交后代幼苗壯苗，即150 g/L香蕉泥+0.5 g/L AC+9 g/L瓊脂粉+20 g/L糖。

2.2.2 雜交幼苗生根 研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加不同的有機(jī)物和活性炭雜交幼苗所產(chǎn)生的根數(shù)和根長(zhǎng)有所不同(表6)。由極差分析可知，活性炭是影響幼根產(chǎn)生的主要因素，隨活性炭濃度的增加，雜交幼苗產(chǎn)生的幼根數(shù)不斷增加，當(dāng)活性炭濃度為1.0 g/L時(shí)，產(chǎn)生的幼根數(shù)平均達(dá)到了6.02條，比不添加活性炭的幼苗平均多2.05條。其次是香蕉泥，隨香蕉泥濃度的增加，雜交幼苗幼根數(shù)也增加，濃度為150 g/L時(shí)產(chǎn)生的幼根數(shù)最多，平均為5.78條。低濃度CH促進(jìn)幼根的產(chǎn)生，高濃度抑制幼根的產(chǎn)生，濃度為2.0 mg/L時(shí)產(chǎn)生的幼根數(shù)比濃度為1.0 mg/L時(shí)產(chǎn)生幼根平均少0.81條。適宜雜交苗幼根產(chǎn)生的理論培養(yǎng)基為150 g/L香蕉泥+1.0 mg/L CH+1.0 g/L AC，與試驗(yàn)值一致，為8號(hào)培養(yǎng)基。

對(duì)雜交幼苗根長(zhǎng)平均值的極差分析可知，有機(jī)質(zhì)和活性炭對(duì)幼根生長(zhǎng)的影響表現(xiàn)為不添加或低濃度更有利。香蕉泥和活性炭在不添加時(shí)平均根長(zhǎng)均表現(xiàn)最好，CH則是低濃度平均根長(zhǎng)優(yōu)于不添加或濃度為2 mg/L的平均根長(zhǎng)。適宜雜交苗幼根生長(zhǎng)是培養(yǎng)基中添加為1.0 mg/L CH，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種培養(yǎng)基中沒(méi)有出現(xiàn)該組合。就各培養(yǎng)基幼苗平均根長(zhǎng)可知，8號(hào)培養(yǎng)基的幼苗新根數(shù)不僅最多，根長(zhǎng)也最長(zhǎng)。因此，生產(chǎn)上可采用8號(hào)培養(yǎng)基作為春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交幼苗生根的適宜培養(yǎng)基。

3 結(jié)論與討論

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)雜交蘭試管苗壯苗和生根所必需的，且不同的種類及其濃度對(duì)試管苗壯苗及生根的影響不同。一般研究認(rèn)為，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比值大時(shí)促進(jìn)生根，反之促進(jìn)發(fā)芽。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交后代幼苗在0.5～1.0 mg/L NAA+0～0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L BA的培養(yǎng)基上幼苗生長(zhǎng)良好，幼苗不僅高且新增芽數(shù)多；在0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA或1.0 mg/L IBA+0.2 mg/L BA的培養(yǎng)基上生根效果好，試驗(yàn)結(jié)果與該說(shuō)法不太一致。在生根培養(yǎng)的過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)BA高濃度容易使根部產(chǎn)生愈傷組織，適當(dāng)增加生長(zhǎng)素的濃度有利于生根，這與左利娟等的研究[10]一致，但是濃度過(guò)高會(huì)使組培苗產(chǎn)生褐化現(xiàn)象。

培養(yǎng)基中添加天然有機(jī)物，如香蕉泥等可豐富培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)并緩沖培養(yǎng)基pH值，被廣泛用于國(guó)蘭的組織培養(yǎng)中[11]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加香蕉泥有利于春蘭宋梅×雜交蘭韓國(guó)桃花雜交后代幼苗壯苗和生根，但香蕉須要打碎才能添加，為確保培養(yǎng)基完全無(wú)菌，須要延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。活性炭能吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)，使培養(yǎng)基變黑促進(jìn)培養(yǎng)物極性的發(fā)生，有利于植物的正常生長(zhǎng)，但同時(shí)也會(huì)吸附加入的植物激素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，合理利用活性炭對(duì)于提高雜交蘭根的生長(zhǎng)有重要作用[12]。試驗(yàn)表明，在添加活性炭的培養(yǎng)基中雜交蘭幼苗不僅生長(zhǎng)良好，生根效果也最好。