郭坤元，林先明，何美軍，郭漢玖

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北恩施 445000)

野葛[Puerarialobata(Willd.) Ohwi]別稱甘葛或者葛藤，是我國(guó)傳統(tǒng)的大宗中藥材，富含淀粉[1]及異黃酮類物質(zhì)[2]，其中淀粉具有可食用性，異黃酮類物質(zhì)具有降血壓血脂[3]、抗氧化[4]、保護(hù)肝[5]等作用，具有良好的食用和藥用價(jià)值。我國(guó)野生和人工栽培的葛類資源年總量比較豐富[6]，但是目前相關(guān)研究大多停留在育種和栽培等比較基礎(chǔ)的層面上，有關(guān)野葛功能基因及調(diào)控機(jī)制的研究還比較少，因此，開展野葛功能基因及調(diào)控機(jī)制的研究迫在眉睫。

核酸酶是一種特異性作用于磷酸二酯鍵的酶，能夠水解核酸鏈生成低聚核苷酸或者單核苷酸[7]，在遺傳物質(zhì)的重組[8]、堿基錯(cuò)配識(shí)別和切割異源DNA[9]等多個(gè)途徑中起著重要的作用，同時(shí)核酸酶活性還依賴于如鈣離子等各種各樣的金屬離子[10-12]。一些植物中的鈣離子依賴性核酸酶已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，比如利用基因芯片技術(shù)在水稻中發(fā)現(xiàn)了1種OsNAC4編碼的參與核DNA降解的鈣離子依賴性核酸酶[13-14]；在小麥中發(fā)現(xiàn)了1種可以凋亡細(xì)胞并降解和碎裂細(xì)胞核DNA的鈣離子依賴性核酸酶[15]；在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了1種分子量為26 ku，對(duì)DNA和RNA均有降解能力的鈣離子依賴性核酸酶[16]，但是到目前為止，在中藥材中有關(guān)核酸酶基因及其功能機(jī)制方面的研究還未見報(bào)道。本研究以野葛為試驗(yàn)材料，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、 cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid-amplification of cDNA ends，簡(jiǎn)稱RACE)等方法克隆野葛鈣離子依賴性核酸酶基因PlCaN的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建，希望可以通過(guò)這些結(jié)果為后續(xù)該基因功能等方面的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野葛試驗(yàn)材料采自華中藥用植物園試驗(yàn)基地，帶回實(shí)驗(yàn)室后用液氮速凍并立即置于-80 ℃儲(chǔ)藏備用。大腸桿菌菌株DH5α保存于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所。

試劑主要包括RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、總RNA提取試劑盒RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、FastQuant RT Kit[天根生化科技(北京)有限公司]、pMD18-T載體試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]、DNA marker[天根生化科技(北京)有限公司]、PCR產(chǎn)物回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，其他生化試劑均為進(jìn)口或者國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 野葛總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 取采集的儲(chǔ)藏于 -80 ℃ 的野葛材料，在液氮下研磨均勻后按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)提取的RNA濃度和質(zhì)量。以提取的RNA為模板，按照FastQuant RT Kit說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 通過(guò)對(duì)GenBank上已經(jīng)登錄的擬南芥(Arabidopsisthaliana，登錄號(hào)AY128927)、煙草(Nicotianasylvestris，登錄號(hào)XM_009798421)、玉米(Zeamays，登錄號(hào)NP_001147648)、谷子(Setariaitalic，登錄號(hào)XM_004968244)、高粱(Sorghumbicolor，登錄號(hào)XM_002457238)、大豆(Glycinemax，登錄號(hào)NM_001255851)等植物的核酸酶氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，挑選出高度保守區(qū)段序列，設(shè)計(jì)引物P1和P2(表1)。

1.2.3PlCaN保守序列克隆 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，擴(kuò)增PlCaN保守區(qū)域片段。PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2.0 μL模板cDNA、5 μL 10×PCR緩沖液、2.5 μL dNTP(10 mmol/L)、各1.0 μL上下游引物(20 μmol/L)、0.5 μL DNA聚合酶(5 U/mL)，用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。目的片段回收和純化按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。將純化回收的DNA連接至克隆載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆接種于含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，由華大基因測(cè)序。

表1 引物名稱和序列

1.2.4PlCaN的RACE擴(kuò)增及全長(zhǎng)cDNA序列的獲得 按照TaKaRa 5′-Full RACE Kit和3′-Full RACE Kit說(shuō)明書將野葛總RNA分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照TaKaRa 5′RACE和3′RACE試劑盒說(shuō)明書以及已得到的核心片段序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)5′-RACE和3′-RACE反應(yīng)所需的引物P3、P4、P5(表1)，分別對(duì)PlCaN的5′端和3′端進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5′-RACE以5′-RACE-first-strand cDNA和Outer PCR產(chǎn)物為模板，3′-RACE以3′-RACE-first-strand cDNA為模板。PCR產(chǎn)物的回收、克隆與測(cè)序方法均同“1.2.3”節(jié)。將PlCaN的核心片段、5′端和3′端序列利用軟件進(jìn)行拼接，獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)拼接得到的全長(zhǎng)序列，分別在5′端和3′端設(shè)計(jì)特異性引物P6、P7(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到目的基因，PCR產(chǎn)物的回收、克隆與測(cè)序方法均同“1.2.3”節(jié)。

1.2.5PlCaN序列的生物信息學(xué)分析 將獲得的PlCaN編碼的氨基酸序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用DNAMAN軟件對(duì)已發(fā)表的其他植物的CaN編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，并通過(guò)MEGA6.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。通過(guò)在線網(wǎng)站分析，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)(http：//web.expasy.org/protparam/)，進(jìn)行疏水性(http：//web.expasy.org/protscale/)，利用TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、信號(hào)肽(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)、亞細(xì)胞定位(http：//psort.hgc.jp/form.html)、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(ExPASy在線)，利用SWISS-MODEL(http：//swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的三維同源建模。

1.2.6 pBRT7-PlCaN表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)目的基因PlCaN的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物P8和P9(表1)擴(kuò)增PlCaN的cDNA全長(zhǎng)。回收PCR產(chǎn)物并將回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，然后測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的pMD18-T-PlCaN質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pBRT7分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用T4連接酶于16 ℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 野葛總RNA的提取與檢測(cè)

如圖1所示，2次提取的RNA電泳條帶清晰，說(shuō)明葉片總RNA提取結(jié)果較好，同時(shí)D260 nm/D280 nm平均值為1.98，說(shuō)明提取的總RNA純度比較高，適用于后期cDNA的制備和PCR擴(kuò)增。

2.2 PlCaN全長(zhǎng)cDNA的克隆

以野葛cDNA為模板，用引物P1、P2擴(kuò)增得到1條約 850 bp 的PCR產(chǎn)物(圖2泳道1)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度符合引物設(shè)計(jì)。通過(guò)在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information，簡(jiǎn)稱NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該序列與其他植物的CaN核酸序列相似度較高，因此推測(cè)該序列為PlCaN基因的保守區(qū)片段。根據(jù)設(shè)計(jì)的RACE引物P3、P4、P5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CaN的5′端980 bp(圖2泳道2)和3′端630 bp(圖2泳道3)，經(jīng)純化回收后連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5α，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。用DNAMAN對(duì)5′-RACE和3′-RACE所得序列和保守區(qū)序列進(jìn)行拼接得到cDNA全長(zhǎng)電子拼接序列，以其為模板設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CaN基因全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1 000 bp左右(圖2泳道4)，并進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行載體連接測(cè)序驗(yàn)證，得到長(zhǎng)度為 1 008 bp 的片段，將該片段再次在NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析，進(jìn)一步驗(yàn)證所得基因序列為PlCaN的cDNA序列。

2.3 PlCaN生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站(http：//web.expasy.org/ protparam/)預(yù)測(cè)PlCaN蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為37.3 ku，等電點(diǎn)為9.4，化學(xué)式為C1 669H2 629N477O479S8，共5 262個(gè)原子數(shù)。蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在第105個(gè)氨基酸位置疏水性最大，峰值為 1.895，在第322個(gè)氨基酸位置親水性最小，谷值為-3.225，整個(gè)分布區(qū)域親水性氨基酸區(qū)域多于疏水性氨基酸區(qū)域，可認(rèn)為PlCaN為親水性蛋白(圖3-A)。TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，PlCaN蛋白沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位分析表明，PlCaN蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)的概率約為0.450，定位于微體的概率約為0.363，定位于其他細(xì)胞器的概率較低。SignalP 4.1 Server分析結(jié)果顯示，C值為0.270，Y值為0.202，S值為 0.265，得分均較低，表明PlCaN蛋白無(wú)信號(hào)肽(圖3-B)。

利用PredictProtein等在線分析軟件對(duì)PlCaN的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由約49%的α-螺旋、19%的β-折疊和32%的不規(guī)則卷曲組成，其中α-螺旋和不規(guī)則卷曲占的比例較高。在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)PlCaN的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與高粱(序列登錄號(hào)為XP_002457283.1)的同源性最高，為88.0%。在PlCaN整個(gè)氨基酸序列中，丙氨酸(Ala)的含量最高，超過(guò)了11%，半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)的含量最低，不到 1.5%(圖4-A)，另外蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示它是由3個(gè)α-螺旋組成中心結(jié)構(gòu)，另外含有1個(gè)β片層和部分不規(guī)則卷曲(圖4-B)，這也與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。

由圖5可知，氨基酸同源性比對(duì)顯示，PlCaN與擬南芥、玉米、谷子、高粱、大豆、煙草等植物的序列相似性較高，平均相似率達(dá)到86.5%。

利用MEGA軟件對(duì)PlCaN進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，選取12種與其同源性較高的植物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖6可知，PlCaN與高粱、水稻(Oryzasativa)的親緣關(guān)系最近，與蕪菁(Brassicarapa)、煙草、樟子松(Pinussylvestris)等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 pBRT7-PlCaN表達(dá)載體鑒定

對(duì)構(gòu)建好的pBRT7-PlCaN表達(dá)載體進(jìn)行PCR鑒定，由圖7可知，PlCaN的長(zhǎng)度為1 000 bp，可見擴(kuò)增片段大小正確，表明蛋白表達(dá)載體pBRT7-PlCaN構(gòu)建成功，可以進(jìn)行后續(xù)的融合蛋白誘導(dǎo)等試驗(yàn)。

3 討論與結(jié)論

野葛是豆科的一種藤本植物，既具有藥用價(jià)值又具有食用價(jià)值，淀粉和葛根黃酮是其主要的功能藥效成分。本研究利用RT-PCR技術(shù)從葛根中克隆了1種鈣離子依賴性的核酸酶，其全長(zhǎng)為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸，序列比對(duì)結(jié)果表明PlCaN與谷子、高粱等有很高的同源性，為Ca2+依賴型，參與降解核酸底物等生理功能[10]；預(yù)測(cè)PlCaN蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為37.3 ku，等電點(diǎn)為9.4，是沒有跨膜結(jié)構(gòu)域、不含信號(hào)肽分子的親水性蛋白，亞細(xì)胞定位，它最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)；蛋白質(zhì)二維和三維結(jié)構(gòu)顯示其α-螺旋和不規(guī)則卷曲所占比例較高；進(jìn)化樹分析表明PlCaN與高粱、水稻的親緣關(guān)系最近，與蕪菁、煙草、樟子松等物種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本研究還構(gòu)建了pBRT7-PlCaN重組質(zhì)粒，并進(jìn)一步鑒定該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功?？傊?，本研究為下一步利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析野葛PlCaN基因時(shí)空表達(dá)特性以及PlCaN蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化和酶活特性研究奠定了基礎(chǔ)。另外，將克隆得到的基因轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中進(jìn)一步研究其功能特征也將是今后的研究方向。