潘銅華 王云龍 楊俊偉 習(xí)林杰 丁娟娟 張 靜鄒志榮

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北設(shè)施園藝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100）

葉片是植物進(jìn)行光合作用及蒸騰作用的重要場(chǎng)所（曹儀植和宋占午，1998；喬寶營(yíng) 等，2004；趙瀅 等，2012），葉面積大小是表征葉片光合能力、蒸騰能力、逆境脅迫程度、植株生長(zhǎng)狀態(tài)以及預(yù)測(cè)植株生產(chǎn)力的重要指標(biāo)（Steinger et al.，2003；田青 等，2008）。葉面積大小的精準(zhǔn)快速測(cè)定，對(duì)于指導(dǎo)栽培管理、實(shí)現(xiàn)水肥管理優(yōu)化、高產(chǎn)高效具有重要意義（陳卓 等，2010；盛雙 等，2011）。目前，測(cè)定葉面積的方法有很多種，如方格法、剪紙稱重法、公式回歸法、葉面積儀法、光電法、數(shù)值圖像處理法、打孔稱重法等（王穎 等，2016）。不同的方法各有利弊，需進(jìn)行綜合評(píng)判（高建昌 等，2011；崔世鋼和秦建華，2017）。相比較而言，方格法具有工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，但是結(jié)果較接近真實(shí)值，常用于對(duì)其他測(cè)定方法所得結(jié)果進(jìn)行校正（柳覲 等，2014；李樂(lè) 等，2016）。剪紙稱重法測(cè)得結(jié)果受葉片形狀及人為因素的影響較大，同時(shí)受紙片均勻度影響（崔世鋼和秦建華，2017）。打孔稱重法操作比較簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，但是結(jié)果重復(fù)性較差，且誤差較大（王留梅 等，2001）。葉面積儀法操作簡(jiǎn)單，但因其掃描方向與速度等受人為因素影響很大，難以實(shí)現(xiàn)勻速，誤差較大（孫嵐和馬德偉，1985）。光電法、數(shù)字圖像處理法等操作較簡(jiǎn)單，但對(duì)操作技術(shù)要求較高，對(duì)于葉緣不規(guī)則的葉片難以捕捉其形狀；同時(shí)，測(cè)定結(jié)果受拍照角度、葉片大小、葉片形狀等多因素以及拍照技術(shù)、AutoCAD、Matlab、PS操作技術(shù)等的影響，且這些軟件操作對(duì)于較多葉片的測(cè)定比較費(fèi)時(shí)（肖強(qiáng) 等，2005；田青 等，2008；張萬(wàn)紅 等，2017）。隨著科技的不斷發(fā)展、儀器設(shè)備的不斷改進(jìn)，采用高端儀器快速準(zhǔn)確測(cè)定葉面積是今后的一種發(fā)展趨勢(shì)（劉關(guān)君 等，2004；孫雪文 等，2005）。

本試驗(yàn)采用EPSON平臺(tái)掃描儀結(jié)合WinRHIZO根系分析系統(tǒng)測(cè)定番茄幼苗葉面積，比較其與常規(guī)葉面積測(cè)定法（方格法、打孔稱重法、葉面積儀法）測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性、精確性與測(cè)定速度，并用不同材料進(jìn)行驗(yàn)證，最后對(duì)篩選出的最佳方法進(jìn)行優(yōu)化。旨在得到一種準(zhǔn)確、精度高且快捷的蔬菜幼苗葉面積測(cè)定方法，為植物生理生態(tài)研究及栽培管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年3～4月在西北農(nóng)林科技大學(xué)北校園藝場(chǎng)及人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。供試材料為金棚1號(hào)番茄、早春2號(hào)黃瓜和碧螺6號(hào)辣椒，由楊凌裕豐農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。蔬菜幼苗種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校園藝場(chǎng)日光溫室中，在四葉一心時(shí)取樣進(jìn)行不同方法葉面積測(cè)定與綜合評(píng)價(jià)。

1.2 主要儀器設(shè)備

愛(ài)普生掃描儀及WinRHIZO根系分析系統(tǒng)（EPSON Perfection V700 Photo，Canada regent，Canada）、AM200葉 面 積 測(cè) 定 儀（AM200，ADC BioScientific Ltd.，Hoddesdon，England）、HYZ-71計(jì)算紙（HYZ-712，上海頂峰繪圖紙廠）、千分之一天平（JD100-3，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

分別剪取四葉一心的番茄、黃瓜及辣椒葉片若干片放在托盤(pán)中，蓋上濕潤(rùn)的紗布，防止葉片萎蔫收縮。依次采取方格法、葉面積儀法、掃描分析法及打孔稱重法對(duì)隨機(jī)選取的4片番茄葉片進(jìn)行葉面積測(cè)定，每個(gè)方法重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤。同時(shí)記錄5次測(cè)定的總時(shí)間，比較4種方法測(cè)定葉面積的用時(shí)長(zhǎng)短。為盡量減少外界環(huán)境對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響，在測(cè)定過(guò)程中，通過(guò)空調(diào)、加濕器控制，使室內(nèi)溫度控制在20℃左右，空氣濕度控制在60%～70%。

方格法：測(cè)定前用吸水紙吸干葉片表面水分，將葉片正面朝下平鋪于25 cm×35 cm大小的計(jì)算紙上，然后用三角板壓住一半，用鉛筆小心繪制另一半的邊緣輪廓，繪制完畢后，用手固定，并用三角板壓住，繪制另一半的邊緣輪廓。每?jī)纱螠y(cè)定間隙用濕毛巾擦拭葉片保持葉片濕潤(rùn)，繪制完立即用濕毛巾覆蓋，以防葉片萎蔫。所有葉片統(tǒng)一進(jìn)行繪制。

葉面積儀法：采用ADC公司生產(chǎn)的AM200型便攜式平板葉面積儀，將葉片正面朝上，夾在平板葉面積儀的掃描區(qū)及透明壓板之間，通過(guò)調(diào)節(jié)掃描器左邊的黑色旋鈕，使測(cè)得葉片長(zhǎng)度盡量接近葉片實(shí)際長(zhǎng)度，按住“start”，勻速緩慢掃描葉片，當(dāng)整個(gè)葉片掃描完畢，再按一次“start”停止掃描，得出葉面積。

掃描分析法：首先將葉片正面朝上平鋪于掃描區(qū)域，選擇掃描像素為200 dpi（高建昌 等，2011）；然后選擇“preview”預(yù)掃描葉片，用適宜大小的虛線框框住預(yù)掃描圖，選擇“scan”進(jìn)行掃描，掃描結(jié)果以JEPG圖片格式保存。最后，插入根系分析儀電子狗，雙擊WinRHZIO軟件，打開(kāi)掃描圖片，用虛線框框住圖片，單擊“OK”，得出測(cè)定結(jié)果，建立一個(gè)text文件保存結(jié)果。

打孔稱重法：采用直徑1 cm的打孔器獲得8個(gè)小圓片，稱取單個(gè)小圓片的質(zhì)量，然后通過(guò)整片葉片的質(zhì)量與單個(gè)小圓片的平均質(zhì)量相比，換算出葉片的葉面積。

方法驗(yàn)證與優(yōu)化：采用方格法和掃描分析法對(duì)黃瓜葉片、辣椒葉片及已知面積的長(zhǎng)方形紙片進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)5次重復(fù)，驗(yàn)證掃描分析法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。對(duì)掃描分析法的不同分辨率（50、96、150、200、300、400、600、800、1 200 dpi） 下 黃瓜葉面積的單次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析，并對(duì)準(zhǔn)確性、精確性、所需時(shí)間等進(jìn)行綜合比較，篩選最佳掃描分辨率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和DPS 7.05統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、方差分析與顯著性檢驗(yàn)（Duncan新復(fù)極差法），采用Excel 2007軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同測(cè)定方法的準(zhǔn)確性與精確性比較

由圖1可知，與方格法相比，葉面積儀法測(cè)定的數(shù)據(jù)顯著偏低（平均降低12%～16%），而打孔稱重法測(cè)定值則顯著升高（平均升高4.2%～12.9%）。采用掃描分析法，除了2號(hào)葉的測(cè)定值顯著低于方格法以外，其余葉片測(cè)定值與方格法無(wú)顯著差異。通過(guò)分析測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)誤可知，打孔稱重法測(cè)得值與平均值之間偏離程度最大，葉面積儀法次之，而方格法與掃描分析法測(cè)定結(jié)果偏離平均值程度較小，說(shuō)明掃描分析法和方格法的精度高，結(jié)果可重現(xiàn)性更好。同時(shí)，相比葉面積儀法和打孔稱重法，掃描分析法測(cè)定值更接近真實(shí)值，可以用于準(zhǔn)確測(cè)定葉面積。

2.2 不同測(cè)定方法的用時(shí)比較

不同葉面積測(cè)定方法5次測(cè)定所需時(shí)間差異顯著（圖2）。方格法所需時(shí)間最長(zhǎng)（5 205 s），葉面積儀法次之（690 s），而掃描分析法（498 s）和打孔稱重法（468 s）用時(shí)最少。綜合比較測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性（圖1）和所需時(shí)間（圖2），掃描分析法是一種快速、準(zhǔn)確且精度高的幼苗葉面積測(cè)定方法。

2.3 葉面積測(cè)定方法驗(yàn)證

2.3.1 黃瓜與辣椒葉片驗(yàn)證 由圖3可知，采用掃描分析法，黃瓜和辣椒葉片葉面積測(cè)定值均顯著低于方格法，分別降低了2.59%和5.56%。掃描分析法的標(biāo)準(zhǔn)誤低于方格法，說(shuō)明掃描分析法測(cè)得的數(shù)據(jù)精度更高，結(jié)果比較可靠。

圖1 不同葉面積測(cè)定方法對(duì)番茄葉片的測(cè)定結(jié)果比較

圖2 不同葉面積測(cè)定方法5次測(cè)定用時(shí)比較

圖3 蔬菜幼苗葉面積掃描分析法測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證

2.3.2 使用已知面積紙片驗(yàn)證 用信封隨機(jī)剪取10個(gè)不同面積的長(zhǎng)方形紙片，用直尺準(zhǔn)確測(cè)定長(zhǎng)和寬并計(jì)算面積，再用掃描分析法進(jìn)行測(cè)定。由表1可知，掃描分析法測(cè)定結(jié)果與直尺測(cè)定值之間的誤差為-2.14%～3.02%，處于±5%之間，數(shù)據(jù)可靠，說(shuō)明掃描分析法的測(cè)定結(jié)果接近真實(shí)值，可用于準(zhǔn)確、快速測(cè)定葉面積。

2.4 掃描分析法中不同dpi設(shè)置的測(cè)定時(shí)間及測(cè)定結(jié)果比較

本試驗(yàn)結(jié)果表明，掃描分析法可以快速、準(zhǔn)確測(cè)定番茄、黃瓜及辣椒葉片的葉面積。以上結(jié)果是在掃描分辨率為200 dpi的條件下所得（高建昌 等，2011）。掃描分辨率是決定掃描儀獲得像素?cái)?shù)量的重要因素，分辨率的高低可能對(duì)測(cè)定面積存在影響（李寶光 等，2006；高建昌 等，2011）。不同掃描分辨率條件下，掃描時(shí)間、掃描結(jié)果可能不同。由圖4-A可知，掃描分辨率越高，掃描及分析所需時(shí)間越長(zhǎng)，其中dpi為50與96時(shí)所需時(shí)間最短，分別為40.9 s和44.5 s，二者無(wú)顯著差異，而96 dpi下測(cè)得的變異系數(shù)更大，50 dpi下的測(cè)定時(shí)間比較穩(wěn)定。150 dpi與200 dpi的所需時(shí)間顯著高于前兩者。由圖4-B可知，不同掃描分辨率下測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。因此，掃描分析法中50 dpi的掃描分辨率即可快速、準(zhǔn)確測(cè)定葉面積。

表1 基于不同面積紙片的掃描分析法測(cè)定結(jié)果驗(yàn)證

圖 4 不同掃描分辨率下單次測(cè)定所需時(shí)間（A）及單個(gè)葉片測(cè)定結(jié)果（B）比較

3 討論

蔬菜幼苗葉面積大小是表征植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)弱的一項(xiàng)重要指標(biāo)（王穎 等，2016）。通常情況下，由于幼苗葉片較軟較薄，且葉面不平，準(zhǔn)確快速測(cè)定葉面積難以實(shí)現(xiàn)。方格法作為一種經(jīng)典的葉面積測(cè)定方法，測(cè)定結(jié)果比較接近真實(shí)值，常用于對(duì)其他測(cè)定方法的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證（柳覲 等，2014；李樂(lè) 等，2016）。因此，本試驗(yàn)選用方格法作為參考，比較幾種方法與方格法測(cè)定值間的差距。葉面積儀法（宋衛(wèi)堂 等，2017；王京偉 等，2017）、打孔稱重法（朱艷 等，2017）是目前測(cè)定幼苗葉面積較為常用的方法。本試驗(yàn)比較了葉面積儀法、掃描分析法和打孔稱重法測(cè)定葉面積的準(zhǔn)確性與精確性，并比較了這些方法的操作簡(jiǎn)便性，可為選擇適宜的葉面積測(cè)定方法提供參考。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用葉面積儀法測(cè)定的結(jié)果顯著低于方格法，可能是由于幼苗葉面積較小，導(dǎo)致操作平板葉面積儀時(shí)難以做到勻速，葉片難以完全掃描的緣故（孫嵐和馬德偉，1985）。而打孔稱重法測(cè)定的葉面積顯著高于方格法，可能是由于幼苗葉脈的密度顯著高于葉肉密度，且越靠近葉脈，葉片厚度增加，密度增大，使得小圓片的密度小于平均葉密度。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，葉面積儀法測(cè)定時(shí)間顯著高于掃描分析法，是因?yàn)槿~面積儀法測(cè)定葉面積時(shí)受主觀因素影響更大，需要不斷調(diào)整明暗程度及手推速度以使測(cè)得葉長(zhǎng)盡量接近實(shí)際葉長(zhǎng)。本試驗(yàn)以黃瓜和辣椒葉片為例，驗(yàn)證掃描分析法的可靠度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)得的辣椒葉片葉面積比方格法降低了5.56%，可能是由于辣椒葉片葉面積明顯小于黃瓜（前者葉面積約為后者的19.05%），導(dǎo)致同樣或較小的絕對(duì)誤差引起了更大的相對(duì)誤差。由于采用方格法測(cè)定葉面積也很難測(cè)得真實(shí)值，而紙片形狀規(guī)則、不易變形的特點(diǎn)更利于真實(shí)值的測(cè)定，因此，本試驗(yàn)進(jìn)行了基于不同面積紙片的掃描分析法結(jié)果驗(yàn)證。測(cè)得結(jié)果與真實(shí)值間的誤差小于黃瓜或辣椒葉面積驗(yàn)證過(guò)程的誤差，可能是由于方格法測(cè)定過(guò)程中下壓葉片的幅度遠(yuǎn)大于掃描時(shí)幅度，導(dǎo)致方格法測(cè)得結(jié)果大于自然狀態(tài)下葉片葉面積，從而使黃瓜和辣椒驗(yàn)證得到的誤差絕對(duì)值高于理論值，這也從另一方面說(shuō)明了掃描分析法結(jié)果的準(zhǔn)確性。

在結(jié)果可靠的基礎(chǔ)上，測(cè)定用時(shí)也是評(píng)價(jià)測(cè)定方法優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同掃描分辨率下的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。隨著掃描分辨率的增加，所用時(shí)間逐漸增加，這可能是由于較大的掃描分辨率使掃描圖片所占磁盤(pán)空間更大，導(dǎo)致電腦運(yùn)行速度減慢，與前人的研究結(jié)果一致（李寶光 等，2006），說(shuō)明掃描分辨率設(shè)定越小越有利于快速準(zhǔn)確測(cè)定葉面積。

目前，測(cè)定植株葉面積的方法有多種（王穎等，2016）。受試驗(yàn)樣品（如葉片大小、葉片是否規(guī)則、是否野外操作等）（苑克俊和孫瑞紅 1994）、設(shè)備條件（設(shè)備價(jià)格、手持靈活性等）（宋英博 等，2015）、試驗(yàn)?zāi)康模ǜ呔葴y(cè)定或粗略估計(jì)、是否破壞性取樣）（肖強(qiáng) 等，2005）等的影響，所選用的葉面積測(cè)定方法不盡一致（柏軍華 等，2005）。因此需要根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康募霸囼?yàn)設(shè)備的易得性，選取合適的葉面積測(cè)定方法。通常，對(duì)于面積比較大的葉片以及只需快速粗略測(cè)定葉片面積時(shí)，建議采取打孔稱重法（烏蘭 等，2015）。對(duì)于設(shè)備比較簡(jiǎn)陋或是缺乏高端設(shè)備（如葉面積儀、高端數(shù)碼儀器）、樣品面積較小且對(duì)結(jié)果要求比較精確時(shí)，可采取公式回歸法（王穎 等，2016）。對(duì)于葉面積很小且要求快速測(cè)定、對(duì)試驗(yàn)結(jié)果要求不太精確時(shí)，可采用葉面積儀法（Qian et al.，2012；Zhang et al.，2015）。對(duì)于條件充足且對(duì)測(cè)定結(jié)果要求非常精確的科研工作者，可選用高端儀器設(shè)備（如數(shù)碼相機(jī)、掃描儀）與先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析軟件（如ImageJ、PS、CAD、Matlab、根系分析儀等）進(jìn)行快速且精確的蔬菜葉面積測(cè)定（高建昌 等，2011；于守超 等，2012；趙瀅 等，2012；Shu et al.，2014；張萬(wàn)紅 等，2017）。方格法作為一種最經(jīng)典、最準(zhǔn)確的葉面積測(cè)定方法，由于其操作的繁瑣性，通常只用于標(biāo)定其他方法的準(zhǔn)確性，而不建議用于實(shí)際的葉面積測(cè)定。

4 結(jié)論

不同葉面積測(cè)定方法所需時(shí)間、測(cè)得結(jié)果的準(zhǔn)確性和精度均存在差異。相比方格法、葉面積儀法和打孔稱重法，掃描分析法兼具準(zhǔn)確性高、精度高且用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。掃描分析法不同掃描分辨率下測(cè)定的葉面積無(wú)顯著差異，且選擇更低掃描分辨率測(cè)定所需時(shí)間更少，結(jié)果可靠。采用50 dpi掃描分辨率測(cè)定蔬菜幼苗葉面積，結(jié)果可靠、精度高、用時(shí)最少，可作為測(cè)定蔬菜幼苗葉面積的首選方法。