朱志強(qiáng) 曾 智 童文羽

紅霉素（Erythromycin，EM）是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，主要應(yīng)用于治療由格蘭氏陽(yáng)性菌和部分格蘭氏陰性菌引起的疾病。近年來(lái)，它在養(yǎng)殖業(yè)，包括水生生物中也得到應(yīng)用。由于該藥物在生物體內(nèi)的代謝時(shí)間較長(zhǎng)，因此容易產(chǎn)生殘留。目前水產(chǎn)品中紅霉素的殘留主要用GB 29684-2013國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，本文在此標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了前處理方法，提高了檢測(cè)效率，并且能夠達(dá)到規(guī)定的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）和同位素內(nèi)標(biāo)法定量，對(duì)草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦等水產(chǎn)品中的紅霉素進(jìn)行了檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 AB QTRAP4500液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源（ESI）、勻漿機(jī)、離心機(jī)、超聲波清洗儀、垂直振蕩器、氮吹儀等。

1.2 材料 草魚(yú)、中華鱉、對(duì)蝦等水產(chǎn)品，采自于養(yǎng)殖場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，去皮去骨去內(nèi)臟取可食部分切碎、混勻、冷凍，作為樣品備用。

1.3 試劑和藥品 甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國(guó)Merck（默克）公司；正己烷（分析純），國(guó)藥集團(tuán)。

表1 梯度洗脫液比例

表2 紅霉素（EM）和紅霉素同位素內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品 紅霉素（EM）標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)Dr公司）、紅霉素同位素標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)CIL氘代試劑)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo C18柱（1.9μm×2.1mm×50mm）;柱溫40℃；進(jìn)樣量10.0μL；流動(dòng)相0.2%甲酸乙腈溶液和0.2%甲酸水溶液，流速0.4mL/min,運(yùn)行時(shí)間10min（見(jiàn)表1）。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式（MRM）；霧化器、碰撞器為氮?dú)?。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)（表2）。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100.0μg/mL）用甲醇配置，紅霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液（0.5μg/mL）用甲醇稀釋?zhuān)患t霉素同位素標(biāo)準(zhǔn)使用液（200.0ng/mL）用甲醇稀釋。準(zhǔn)確量取一定量的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用30%的甲醇稀釋成濃度為5.0ng/mL、15.0ng/mL、25.0ng/mL、35.0ng/mL、50.0ng/mL、100.0ng/mL、200.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液，氘代紅霉素的濃度均為10.0ng/mL。

3.2 樣品前處理

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

準(zhǔn)確稱量5.00g勻漿樣品，置于50mL離心管中，加入200ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液50.0μL，加入10mL乙腈，垂直振蕩1min，超聲5min，然后4500轉(zhuǎn)離心5min，取上清液至另一50mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并提取液，加入15mL正己烷振蕩1min，4500轉(zhuǎn)離心5min，棄去正己烷，取下層溶液10mL40℃氮吹吹干，加入1.0mL30%甲醇，渦旋，再加入2mL正己烷渦旋30秒，4500轉(zhuǎn)離心5min，棄去正己烷，樣液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后，待上機(jī)分析。

表4 紅霉素的添加濃度及其平均回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（n=3）

3.3 樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取紅霉素的陰性樣品5.00g，添加濃度為0.5μg/mL的紅霉素使用液10μL、50μL、200μL共3組，加入濃度為200.0ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液50.0μL，每組3個(gè)平行樣。

4 結(jié)果與討論

4.1 紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

按上述色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定一系列6個(gè)質(zhì)量濃度的紅霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性范圍為5.0～200.0ng/mL，線性方程為y=0.13798x+0.08726，線性相關(guān)系數(shù)為0.99966，定量限為1.0μg/kg（見(jiàn)表3）。

4.2 不同水產(chǎn)品中紅霉素含量的檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表4）

紅霉素檢測(cè)的線性范圍為5.0～200.0ng/mL，定量限為1.0μg/kg，在加標(biāo)量為5.0μg/kg、25.0μg/kg、100.0μg/kg時(shí)，樣品加標(biāo)回收率均在80%～120%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于10.0%（不同水產(chǎn)品加標(biāo)量為100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1-3）。

4.3 結(jié)論

目前水產(chǎn)品中紅霉素的殘留量主要按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 29684-2013進(jìn)行檢測(cè)，此方法在實(shí)際操作中步驟較為繁瑣，前處理時(shí)間較長(zhǎng)，且存在一定的污染風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了前處理方法，用氮吹取代旋蒸，同時(shí)簡(jiǎn)化操作步驟，節(jié)省操作時(shí)間，且檢測(cè)結(jié)果均能滿足檢測(cè)要求，提高了檢測(cè)效率。

圖1 草魚(yú)添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖

圖2 中華鱉添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖

圖3 對(duì)蝦添加100.0μg/kg離子質(zhì)量色譜圖