苗利娟，石 磊，韓鎖義，黃冰艷，董文召，齊飛艷，房元瑾，張新友

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮海油料作物重點實驗室/河南省油料作物遺傳改良重點實驗室，河南 鄭州 450002)

花生作為我國重要的油料作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。近年來，我國花生種植面積逐漸擴大，已成為世界上花生第一生產(chǎn)和消費大國[1]，但由于當前推廣的花生栽培品種遺傳基礎比較狹窄，抗病抗逆性較差，進而影響花生產(chǎn)量和質(zhì)量進一步提高[2-3]。隨著生物技術的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因及離體誘變技術受到廣大研究者的重視。遺傳轉(zhuǎn)化及離體誘變的成功與否依賴于花生組織培養(yǎng)高效再生體系的建立。研究者們利用花生不同基因型、不同外植體，通過器官發(fā)生和胚胎發(fā)生途徑得到了再生植株，建立了花生高效植株再生體系[4-6]。但花生組培再生苗的根系較弱，其移栽成活率較低，尤其是通過轉(zhuǎn)基因和突變體篩選等技術得到的具有優(yōu)良性狀的花生再生苗難以高成活率移栽，嚴重影響了后續(xù)工作的順利開展。再生苗嫁接是解決組培苗移栽成活率低的有效手段[7]。嫁接技術在園藝作物上應用較廣泛[8-9]，隨著嫁接技術的不斷發(fā)展，嫁接在棉花[10]、油菜[11]和大豆[12]上也有應用，大豆[13]和綠豆[14]等通過遠緣嫁接獲得變異新種質(zhì)，目前已突破其傳統(tǒng)的繁殖意義，而廣泛應用于植物的栽培生產(chǎn)、育種實踐和基礎理論研究等方面?；ㄉ藿臃矫鎽脠蟮垒^少，有研究表明,采用14 d的花生實生苗為砧木，用不同的嫁接方法(劈接法、合接法和插接)，以實生苗和轉(zhuǎn)基因組培苗為接穗，嫁接部位為上胚軸[15]，結果顯示劈接法操作簡單，成活率高。還有報道無菌嫁接方法，采用12～15 d苗齡的無菌幼苗作砧木，花生組培苗為接穗，嫁接于下胚軸，無菌條件下進行嫁接，之后在無菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)使傷口愈合，成活后，取出嫁接苗，用水將嫁接植株根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，再移栽到育苗基質(zhì)中，室內(nèi)馴化3周，成活后移栽田間[16]。為解決組培苗及轉(zhuǎn)基因苗生根困難及移栽成活率低，以及組培苗移栽后長勢較弱等問題，本研究采用劈接法，以不同花生品種實生苗作為砧木，以4個不同類型花生品種的組培苗為接穗，分別采用花生的上胚軸和下胚軸為嫁接部位，對不同品種嫁接成活率及生長情況進行研究，旨在為花生轉(zhuǎn)基因苗及抗性突變體材料的高成活率移栽提供有效的方法。

1 材料和方法

1.1 供試品種

砧木材料：多粒紅籽花生品種四粒紅(簡稱四)；黑籽花生品種豫花0215(0215)。

接穗材料：普通大果型花生品種豫花9326(9326)、濮科花16號(P16)；珍珠豆型花生品種豫花22(Y22)、遠雜9307(9307)。

1.2 試驗方法

1.2.1 砧木材料的準備 選用成熟飽滿的花生種子于培養(yǎng)箱中催芽，露白后將種子種植于高壓滅菌的蛭石中，室溫25 ℃，生長10 d，長出2～3片真葉后作為砧木材料。

1.2.2 無菌組培苗接穗的準備 將4 d苗齡的花生幼葉接種于誘導培養(yǎng)基上，誘導培養(yǎng)3周，形成不定芽后將不定芽轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進一步分化，不定芽長出2片葉，約2 cm作為嫁接接穗材料。

1.2.3 嫁接方法及嫁接部位 采用劈接法，嫁接部位為花生的上胚軸和下胚軸。上胚軸的嫁接方法：切除頂芽及側芽，取子葉節(jié)以上的上胚軸部分，用手術刀片從中間垂直劈開，切口0.5～1 cm；以組培苗為接穗，從基部切掉再生苗，下端切成0.5～1 cm的切口，切口保持光滑平整；將接穗插入制備好的砧木材料中，使接穗和砧木緊密接觸，用Parafilm封口膜纏緊。下胚軸嫁接切掉子葉以及以上部位，嫁接方法同上胚軸嫁接。嫁接后覆膜保濕，避免陽光直射，適當澆水，7～10 d后去掉薄膜。

1.2.4 嫁接苗的馴化移栽 成活的嫁接苗長出新葉后于傍晚或陰天移栽至大田，移栽前澆透水，避免移栽過程中傷根，搭建遮陽網(wǎng)遮陰，2周后嫁接苗長出新葉，去掉遮陽網(wǎng)，大田常規(guī)管理。

2 結果與分析

2.1 不同嫁接部位對花生嫁接成活率及結實率的影響

以上胚軸和下胚軸為嫁接部位，同一品種不同嫁接部位的成活率差別不大，而品種間的成活率差異較大，豫花0215在上胚軸和下胚軸砧木上的平均成活率分別為95%和96%，四粒紅在上胚軸和下胚軸砧木上的平均成活率分別為74%和67%(圖1)。上胚軸嫁接苗移栽田間后砧木上會有側芽生長，需經(jīng)常去掉側芽，而下胚軸嫁接省去這一環(huán)節(jié)。上胚軸嫁接由于砧木上側芽去除不徹底，收獲時發(fā)現(xiàn)砧木和接穗上均有結果現(xiàn)象(圖2A—D)。而下胚軸嫁接無側芽生長，整株植株只有接穗結果(圖2E—H)，并且下胚軸嫁接的結實性優(yōu)于上胚軸，因此，最佳的嫁接部位為下胚軸。

圖1 不同品種砧木及嫁接部位的嫁接成活率

(上)表示嫁接部分為上胚軸；(下)表示嫁接部位為下胚軸。下同圖2 不同花生品種不同嫁接部位的結實情況

2.2 不同品種砧木對花生嫁接成活率及結果的影響

分別以豫花0215和四粒紅為嫁接砧木，嫁接成活率差別很大，豫花0215作砧木嫁接的成活率平均為94.5%，而四粒紅的成活率平均為65.1%，豫花0215作砧木嫁接成活率高于四粒紅。豫花0215作砧木的嫁接苗田間長勢較旺,結實性較好。部分四粒紅上胚軸作砧木的的嫁接苗接穗幾乎沒有分枝生長，沒有果實(圖3)，結果表明，豫花0215作砧木優(yōu)于四粒紅。

圖3 四粒紅和豫花0215為砧木的嫁接成活率

2.3 不同品種花生作接穗嫁接成活率及結實情況

采用4個花生品種的組培苗嫁接到不同的砧木上，嫁接成活率差別較大。珍珠豆類型的花生品種嫁接平均成活率較高，其中豫花22成活率最高，為90%以上，豫花22嫁接到砧木豫花0215上，嫁接成活率達到96%。濮科花16號嫁接成活率最低，成活率平均為84.2%，4個品種的嫁接成活率都在80%以上。田間長勢和結實方面，珍珠豆型品種結實性較好(圖4)，嫁接部位為上胚軸的嫁接植株，豫花22和遠雜9307，除了砧木側芽結果之外，接穗上也有結果現(xiàn)象，而豫花9326和濮科花16號，基本上都是砧木上結果，接穗上幾乎無結果。嫁接部位為下胚軸的嫁接苗，豫花22和遠雜9307結實性較好，而豫花9326和濮科花16號的嫁接苗多數(shù)是不育株。

圖4 不同花生品種接穗的成活率

2.4 花生嫁接苗中不育株的產(chǎn)生

濮科花16號和豫花9326作接穗在2種砧木上嫁接都出現(xiàn)了不育株，2種砧木上嫁接共成活25株，其中濮科花16號在四粒紅上嫁接出現(xiàn)6株不育株，在豫花0215上出現(xiàn)6株不育株，不育株占嫁接總數(shù)48%(圖5A、B)。豫花9326在豫花0215上嫁接成活16株，其中6株不育，不育株占37.5%(圖5C、D)。嫁接植株都能正常開花，除了不育株之外，成活的嫁接植株結實性差，只有1～2個果，將不育株組培接種，組培苗移栽田間后，仍然出現(xiàn)不育。

圖5 濮科花16號出現(xiàn)的不育株

2.5 花生組培苗的嫁接、馴化移栽及結果情況

通過比較上胚軸和下胚軸2個嫁接部位，上胚軸嫁接是在子葉節(jié)以上，操作比較方便(圖6A)，而下胚軸大多數(shù)在土里，嫁接時需要將下胚軸漏出土面，嫁接時操作有障礙(圖6B)，嫁接后覆膜保濕，嫁接7 d后有新葉長出(圖6C)，成活后去掉塑料薄膜，逐漸見光培養(yǎng)，7 d左右即可移栽大田，移栽大田后，遮陽網(wǎng)遮陰(圖6D)，避免陽光直射，2周后嫁接苗成活去掉遮陽網(wǎng)，正常田間管理，嫁接植株都能正常開花(圖6E)，個別品種不結實。

圖6 組培苗的嫁接、移栽生長情況

3 結論與討論

植物嫁接最早起源于我國，是常規(guī)的無性繁殖技術，在果樹、蔬菜、花卉等許多生產(chǎn)領域應用廣泛，通過嫁接提高植株的抗性、增加產(chǎn)量和改變品質(zhì)等[17]。隨著嫁接技術的不斷發(fā)展，嫁接技術已應用到植物組織培養(yǎng)、基因工程和植物生命科學等領域，例如，棉花從愈傷誘導到到分化成苗需要10個月以上，并且組培苗生根移栽成活率較低，利用嫁接大大提高了棉花轉(zhuǎn)基因植株的移栽成活率[18]，花生也存在類似的情況，最近幾年，花生組培苗、轉(zhuǎn)基因植株及誘變后代也采用嫁接方法移栽大田[19]，但都是親緣關系比較近的同種嫁接，其他作物上有采用遠緣嫁接改變后代材料性狀的相關研究[20-21]。

本研究采用四粒紅和豫花0215實生苗作砧木，這2個品種都有獨特的特點，粒色分別為紅色和黑色，嫁接后砧木上側芽有結實情況，非常容易區(qū)分，豫花0215作砧木嫁接成活率高于四粒紅，并且結實性優(yōu)于四粒紅。豫花0215作砧木，嫁接部位為上胚軸的，收獲時發(fā)現(xiàn)砧木和接穗上都有結實現(xiàn)象，而四粒紅作砧木，嫁接部位為上胚軸時，接穗基本不分枝生長，砧木側枝生長旺盛，收獲時發(fā)現(xiàn)只有砧木上有結果，接穗上幾乎無結果，這可能與花生品種特性有關，四粒紅為農(nóng)家種，不容易馴化，對外來嫁接枝條有排斥現(xiàn)象。

同一品種不同嫁接部位，嫁接成活率差異不大，不同品種間嫁接成活率存在很大差異，這在其他植物上也表現(xiàn)出嫁接親和力的差異[22]。嫁接部位為上胚軸時，由于上胚軸離土面較遠，更易于操作，嫁接效率高于下胚軸，但下胚軸幾乎都在土里，嫁接時需將下胚軸漏出土面，嫁接時操作很受限制，從田間長勢及結實情況來看，下胚軸優(yōu)于上胚軸，上胚軸嫁接的植株，移栽田間后需經(jīng)常去除側芽，摘掉后還會在生長，不容易去除干凈，收獲時發(fā)現(xiàn)植株上砧木側芽有結實現(xiàn)象，并且砧木上側芽生長旺盛，嚴重影響接穗的生長及結實，同一植株上既有砧木上結有果實又有接穗上結有果實，而下胚軸移栽后省去了去除側芽的麻煩，營養(yǎng)更好地供給了接穗，結實情況優(yōu)于上胚軸，下胚軸是理想的嫁接部位，這與李冠等[19]研究結果一致。但由于下胚軸較短不便于操作，嚴重影響嫁接速度，今后可以通過其他方法增加下胚軸長度，可以嘗試砧木材料采用暗培養(yǎng)做進一步的研究。

不同品種接穗嫁接成活率有很大差別，珍珠豆型的品種嫁接成活率較高，田間長勢及結實性也較好，豫花9326和濮科花16號作接穗，嫁接至上胚軸上基本無結果，大多數(shù)是砧木側枝結果；而嫁接至下胚軸的，雖然分枝較多，田間長勢較旺，但大多數(shù)不結果，出現(xiàn)大量不育株，但不育株都能正常開花，對其花粉育性進行檢測，只有10%左右的育性，屬于高度不育，出現(xiàn)大量不育株的原因尚不明確，目前有報道，綠豆嫁接到鳳仙上出現(xiàn)空夾現(xiàn)象，棉花不同品種嫁接出現(xiàn)不吐絮[23]。這些不育株通過組培保存下來，可以進一步研究，對花粉育性可做進一步測試，還可以借助分子手段做進一步探索。

不同花生品種嫁接，嫁接成活率存在很大差異，不同的嫁接部位嫁接成活率差別不大，比較理想的嫁接部位是下胚軸；通過嫁接可以大大提高移栽成活率，并且田間長勢較好，都能正常開花，結實性較好，個別植株出現(xiàn)不育。