趙 吉 劉文斌 陳洪強劉晉祎楊惠芳* 曹佳*

（1．寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院，寧夏銀川 750004；2．陸軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學院毒理學研究所，重慶 400038）

肝癌是最為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年肝癌在全世界癌癥的死因中位列第2位，其發(fā)病率和死亡率不斷升高[1]。而對肝癌的治療手段主要是肝切除和肝移植[2]，以及一些適當?shù)乃幬镏委?，但只?%～10%新發(fā)肝癌患者可以進行手術切除，而且術后具有較高的復發(fā)率[3]。同時很多患者都是在晚期才確診，這也是導致肝癌患者生存率較低的因素之一。因此，篩選出可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的生物標志物[4]，可以作為降低肝癌的發(fā)生率、死亡率以及改善肝癌病人預后的重要手段，具有十分重要的科學和臨床價值。

在前期的篩選實驗研究中[5]，我們通過甲基化芯片和表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)WFDC1(whey acidic protein four-disulfide core domain 1)基因在肝癌組織中有較高的甲基化水平且表達下調，因此我們推測它可能是一個候選的抑癌基因。WFDC1基因定位于染色體16q24[6]，這是癌癥中雜合性頻繁喪失的一個區(qū)域，它在前列腺癌[7]、 黑色素瘤[8]、 纖維肉瘤[9]等腫瘤中表達均明顯下調。目前還未見有關WFDC1基因在肝癌組織中的表達情況及其與患者生存和預后關系的文獻報道。為了分析WFDC1基因在肝癌患者中的表達情況，探討該基因在肝癌患者中的表達是否可以作為肝癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的生物標志和生存預后的指標，我們采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測了40例肝癌患者的腫瘤組織和癌旁組織，以及肝癌細胞株和微囊藻毒素(microcystin-leucine arginine，MCLR)誘導的L02惡性轉化細胞中WFDC1 mRNA的表達水平，同時利用腫瘤基因圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中表達的數(shù)據(jù)，分析了該基因表達與臨床病理指標以及肝癌患者生存預后的相關性。

1 材料與方法

1.1 細胞株和細胞培養(yǎng)

正常人肝細胞株L02、肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7，均購于中國科學院上海細胞庫。肝癌細胞株SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。L02細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

在L02細胞培養(yǎng)過程中，采用10 μg/L的微囊藻毒素連續(xù)染毒培養(yǎng)至35代，分別在第5、15、25、35代收取細胞樣品，命名為P5、P15、P25、P35。同時采用軟瓊脂實驗和裸鼠成瘤實驗對不同代數(shù)的惡性轉化細胞進行了惡性程度的檢測[5]。

1.2 臨床樣本

40例肝癌患者的癌組織和癌旁組織來源于陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院手術切除的肝癌患者的組織，距離腫瘤邊緣5 cm以外的組織作為癌旁對照組，所有肝癌組織和癌旁組織都經(jīng)過病理驗證。取出樣本后立即置于液氮中速凍然后置于-80 ℃冰箱保存。所有樣本的采集均取得患者知情同意并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.3 細胞總RNA提取

向細胞培養(yǎng)皿中加入2 mL PBS進行沖洗，然后加入1 mL Trizol，用槍反復吹打。將液體轉移到新的1.5 mL EP管中，加入0.4 mL的氯仿，劇烈搖動1 min。室溫靜置2～3 min后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min。然后取上清無色水相到 EP管，加0.5 mL預冷的異丙醇，在 -20 ℃ 放置 2 h。然后 12 000 r/min、 4 ℃ 離 心10 min，棄去上清，75%乙醇1.0 mL洗滌后，12 000 r/min、4 ℃離心5 min。吸干上清。晾干乙醇10 min，加入DEPC處理水20～30 μL混勻，溶解總RNA，測RNA的濃度值。

1.4 組織RNA提取

稱取組織樣本0.3～0.5 g，放入預冷的研磨器中，加入1～2 mL Trizol充分研磨樣品。其余步驟與細胞提取RNA步驟相同。

1.5 mRNA表達分析

1.5.1 引物設計 根據(jù)GenBank中的基因序列，用Primer 5.0設計引物，并由上海生工生物公司合成。引物序列如表1。

表1 引物序列與產(chǎn)物長度

1.5.2 RNA逆轉錄和實時熒光定量PCR采用Promega逆轉錄試劑盒，步驟參照試劑盒說明書，用3 μg的RNA為模板合成cDNA，用SYBR?P remix E x T aqTMⅡ試劑盒在PCR儀(美國伯樂公司)進行PCR擴增。反應體系為：上下引物各0.5 μL，cDNA為9 μL，Mix為10 μL，總體系20 μL。反應條件：95 ℃、40 s；95 ℃、40s，60℃、40 s，72 ℃、50 s，共45個循環(huán)；72 ℃、5 min。為了檢測引物的特異性，設定熔解曲線(60～95℃)。每個樣本進行3個復孔檢測，采用2-△△CT對PCR結果進行相對定量分析。

1.6 TCGA數(shù)據(jù)庫臨床樣本數(shù)據(jù)

肝癌患者基因表達和臨床資料數(shù)據(jù)從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取(http://tcgadata.nci.nih.gov)。肝癌患者WFDC1 基因的表達的數(shù)據(jù)集ID為LIHC.sampleMap/HiSeqV2_PANCAN，肝癌患者相關臨床病理指標的數(shù)據(jù)集ID為TCGA.LIHC.sampleMap/LIHC_clinicalMatrix。獲得具有WFDC1基因表達數(shù)據(jù)的肝癌患者的肝癌組織331例，并收集臨床病理指標(年齡、性別、腫瘤分期、臨床分期)和危險因素等資料。在331例肝癌患者中有50例肝癌患者具有腫瘤和癌旁組織配對標本。將數(shù)據(jù)庫中331例肝癌患者WFDC1基因表達數(shù)據(jù)取中位數(shù)，將高于中位數(shù)的值定義為高表達，低于中位數(shù)的值定義為低表達。

1.7 Kaplan-Meier分析

通過對WFDC1基因表達數(shù)據(jù)庫的整理，我們以WFDC1 mRNA表達的平均值為界限值將肝癌患者劃分為低表達與高表達兩個組別，用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表達與肝癌患者生存預后之間的關系。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫變量的調整[腫瘤(1+2)期和(3+4)期[10]]，然后分別對變量使用Kaplan-Meier法進行生存分析。所有患者結局的標準均以肝癌引起的死亡。

1.8 特異度和靈敏度分析

通過對WFDC1 mRNA表達的數(shù)據(jù)和臨床資料的整理和分析，主要利用肝癌患者和癌旁組織基因表達以及腫瘤分期[(1+2)期和(3+4)期]的數(shù)據(jù)，用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)模型分析WFDC1基因表達作為肝癌患者臨床診斷指標的特異度和靈敏度。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)統(tǒng)計進行分析。用t檢驗分析WFDC1基因在肝癌組織與癌旁組織間的表達差異，用方差分析WFDC1基因在惡轉細胞中各個代數(shù)的表達差異以及在不同肝癌細胞中的表達差異。χ2檢驗分析WFDC1基因表達與不同臨床分期、腫瘤分期的差異以及分析該基因與臨床基本病理指標和危險因素之間的相關性。通過ROC曲線模型分析WFDC1基因表達對患者臨床診斷的價值。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 WFDC1 mRNA在肝癌細胞和MC-LR誘導的L02惡性轉化細胞中的表達水平

我們采用qPCR法檢測了在不同肝癌細胞株和MCLR誘導的L02惡性轉化細胞中的WFDC1 mRNA表達水平。結果表明，與L02細胞比較，WFDC1 mRNA在SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7等4種肝癌細胞株中均低表達(圖1A)。同時隨著MC-LR誘導的L02惡性轉化細胞代數(shù)的不斷增加，WFDC1 mRNA的表達逐步下調(圖1B)。

圖1 WFDC1 mRNA在肝癌細胞株和MC-LR誘導L02惡性轉化細胞中的表達水平

2.2 WFDC1 mRNA在肝癌患者癌組織和癌旁組織中的表達水平

qPCR結果表明，在40例肝癌患者中，WFDC1 mRNA在癌組織的表達顯著低于癌旁組織 (圖2，t=5.624，P＜0.01)。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中WFDC1 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況

為了進一步驗證該基因在臨床組織樣品的實驗結果，我們利用genome-cancer(https://genome-cancer.ucsc.edu)網(wǎng)絡分析WFDC1 mRNA在肝癌組織和癌旁組織中的表達情況，見圖3。結果表明，WFDC1 mRNA在肝癌組織中的表達明顯低于癌旁組織中的表達(圖3B，t=3.551，P＜ 0.01)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中的50例肝瘤組織及其配對的50 例癌旁組織中也發(fā)現(xiàn)，WFDC1 mRNA的表達在肝瘤組織明顯低于癌旁組織。兩組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(圖3C，t=3.990，P＜0.01)，與實驗結果基本一致。

圖2 WFDC1 mRNA在肝癌患者腫瘤及癌旁組織中的表達水平

2.4 WFDC1 mRNA表達與肝癌患者臨床指標和疾病危險因素之間的關系

我們對WFDC1 mRNA的表達情況按不同的臨床病理特征和不同的危險因素進行分組分析，以此來確定該基因的表達情況與肝癌患者的危險因素以及臨床病理指標之間的關系。結果表明，WFDC1 mRNA的表達在不同腫瘤分期和臨床分期中差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但與患者的年齡、性別、是否飲酒、是否有病毒感染(HBV和/或HCV)等危險因素無顯著相關性(P＞0.05)(表2)。

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析WFDC1 mRNA在癌旁組織和肝癌組織中的表達

表2 WFDC1 mRNA表達情況與肝癌臨床病理特征和危險因素的關系

2.5 WFDC1 mRNA表達與肝癌患者生存預后之間的關系

我們采用Kaplan-Meier的方法分析WFDC1 mRNA表達與肝癌患者生存預后的關系。結果表明，WFDC1 mRNA表達與肝癌患者術后的生存時間有顯著相關性，WFDC1 mRNA高表達患者的術后生存時間顯著高于低表達的患者，差異具有統(tǒng)計學意義(圖4A，Logrank=4.80，P＜0.05)。按腫瘤分期進行分類分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤(1+2)期中，WFDC1 mRNA高表達患者的術后生存時間顯著高于低表達患者(圖4B，Log-rank=3.92，P＜0.05)，而在腫瘤(3+4)期的肝癌患者中，低表達患者的術后生存時間與高表達組無顯著相關性(圖2C，Logrank=0.001，P＞0.05)。

2.6 WFDC1 mRNA表達在肝癌中的診斷價值

為了更加明確WFDC1 mRNA的表達在肝癌診斷中的價值，我們利用ROC模型對該基因表達情況進行了分析。結果表明，WFDC1 mRNA表達在肝癌中具有較好的特異度和靈敏度，ROC曲線下面積AUC= 0.829，95%CI為0.788～0.871(圖5A)。而在腫瘤(1+2)期，ROC曲線面積AUC=0.834，95%CI為0.789～0.879 (圖5B)。在腫 瘤 (3+4)期 ， ROC曲 線 面 積 AUC=0.832， 95%CI為0.765～0.899(圖5C)。提示該基因是一個潛在的診斷標志物。

圖4 肝癌患者WFDC1 mRNA表達的Kaplan-Meier生存曲線

圖5 WFDC1 mRNA表達在肝癌診斷中的ROC曲線

3 討論

WFDC1蛋白含有220個氨基酸，包括了23個酸性氨基酸、30個堿性氨基酸、48個極性以及65個疏水氨基酸，同時大鼠和人的WFDC1基因均含7個外顯子，并且在外顯子2上幾乎包括了同樣的乳清酸序列[11]。WFDC1蛋白也是乳清酸蛋白家族的一員，這個家族的特點就是至少含有一個由50個氨基酸組成的乳清酸蛋白的序列，其中就包含了由8個氨基酸高度保守的半胱氨酸殘基所形成的4個二硫鍵[12]。WFDC1基因定位于16q24染色體，這是癌癥中雜合性頻繁喪失的一個領域，該基因可能有抑癌因子的功能[13]。WFDC1基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展都有聯(lián)系，包括前列腺癌[14]、 乳腺癌[15]、 肝細胞癌[16]、 黑色素瘤等[8]，并且可能參與抑制細胞增殖。編碼的蛋白質也可能在某些CD4記憶T細胞對人類免疫缺陷病毒感染的易感性中起作用[17]。PS20通過調節(jié)細胞間綴合物的形成而成為HIV-1易感染的CD4+T細胞的新型標志物[18]。目前WFDC1基因與肝癌的發(fā)生和機制方面的研究比較少，尤其與臨床生存預后的研究目前還未見報道。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，該基表達因在癌組織中顯著下調。同時在不同的肝癌細胞株以及MC-LR誘導的惡性轉化細胞中證實WFDC1 mRNA表達顯著下調，由于隨著MC誘導的惡轉細胞代數(shù)的增加，該基因的表達也逐步下調，提示該基因參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。通過對TCGA數(shù)據(jù)庫的大樣本數(shù)據(jù)分析，也證實該基因在腫瘤組織的表達低于癌旁組織，提示W(wǎng)FDC1可能在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮抑癌作用，有必要進一步開展系統(tǒng)的實驗研究。

WFDC1 mRNA在肝癌患者生存預后的分析中表明，WFDC1 mRNA的表達與腫瘤分期以及臨床分期有顯著相關性，該基因高表達患者的術后生存時間明顯高于低表達患者。而與患者的年齡、性別、是否飲酒、是否有病毒感染等危險因素無顯著相關性。這提示我們WFDC1 mRNA的表達與腫瘤分期有著密切的聯(lián)系，有可能對肝癌患者生存預后的判斷有一定的診斷價值。ROC模型分析表明WFDC1 mRNA的表達水平在肝癌患者的診斷中具有較高的特異度和靈敏度(AUC=0.829， 95%CI為 0.788～0.871)， 這 提 示 我 們 WFDC1 mRNA的表達可用于肝癌的初步診斷。由于目前我們只是在肝癌細胞株和臨床組織標本中做了部分驗證實驗以及用TCGA數(shù)據(jù)庫表達的數(shù)據(jù)去分析，所以對于該基因作為分子診斷的生物標志物還需要更多的臨床標本去驗證，而具體的功能還需要更大的樣本去進行研究。

綜上所述，WFDC1基因在肝癌中的表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及與肝癌患者的生存預后有密切相關性，是一個重要的候選生物標志物。同時WFDC1基因在肝癌中可能是一個潛在的抑癌基因，有必要進一步去研究該基因在肝癌中的機制及功能，為全面掌握WFDC1基因在腫瘤中的作用奠定基礎。