孔瑩瑩劉 安許 偉張 拓龔志華肖文軍,3

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

茶葉是中國主要經(jīng)濟作物之一，在浙江、云南、安徽、湖南等地多有種植。中國每年茶葉深加工消耗茶葉1.0×105～1.5×105t，占茶葉總產(chǎn)量的7%～9%[1]，而日本、美國茶葉深加工占比已達到40%以上[2]，說明中國茶葉深加工產(chǎn)業(yè)發(fā)展空間巨大，且深加工后的茶渣并未得到妥善處理。研究發(fā)現(xiàn)，深加工后的茶渣仍殘留17%～19%的粗蛋白、16%～18%的粗纖維[3]，可做肥料、飼料和吸附劑，可從中提取利用蛋白、茶多糖[4]。其中，將茶渣纖維素轉(zhuǎn)化為燃料乙醇不僅能減少環(huán)境污染，還可緩解能源危機[5]。近期研究[6]發(fā)現(xiàn)Co60輻照可使油菜秸稈的纖維素發(fā)生鏈剪切和交聯(lián)反應，降解纖維素；堿處理玉米秸稈，可使纖維素的氫鍵斷裂[7]；孫萬里等[8]發(fā)現(xiàn)酸處理水稻秸稈能脫除木質(zhì)素、半纖維素，使糖得率提高；彭資等[9]發(fā)現(xiàn)酸能促進輻照芒草纖維素降解糖化。然而，目前相關研究主要是以農(nóng)作物秸稈為原料，鮮有對茶渣降解糖化的研究。已有研究[10]表明茶渣可用纖維素酶解，提取蛋白和還原性糖，但還原糖得率較低。以上研究擬主要使用單一技術降解，而非多種方法綜合降解。因此本研究擬以茶渣為原料，分別采用Co60輻照、氫氧化鈉、硝酸處理，并通過3,5-二硝基水楊酸法測定水溶性還原糖的得率，探討不同降解方法的效果，以期為茶葉深加工中茶渣的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

茶渣：為中小種綠茶在茶水比1∶15 (g/mL)、95 ℃下提制30 min后的水提殘渣，于70 ℃烘箱中烘干，粉碎，過40目篩。經(jīng)檢測，茶渣中有15.05%纖維素、4.21%果膠、1.76% 水溶性還原糖，含水量為4.73%；

乙二胺四乙酸二鈉、硼酸鈉、十二烷基硫酸鈉、乙二醇乙醚、無水磷酸氫二鈉、濃硫酸、十六烷三甲基溴化銨、無水亞硫酸鈉、氰化萘、丙酮、無水草酸氨、氨水、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、冰乙酸、無水氯化鈣、葡萄糖標準物質(zhì)、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉、濃硝酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器

電子天平：FA2104S型，上海精科天美儀器有限公司；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D(Ⅲ)型，浙江黃巖求精真空泵廠；

電熱鼓風干燥箱：101A-2型，上海實驗儀器總廠；

恒溫水浴鍋：HH數(shù)顯型，金壇市金城國勝實驗儀器廠；

可見光光度計：722E型，上海光譜儀器有限公司。

1.2 降解方法

1.2.1 輻照降解 選擇Co60為輻照源，將烘干后的茶渣以200，600，800，1 000，1 200 kGy的輻照劑量進行輻照降解，優(yōu)選水溶性還原糖得率高的輻照劑量。

1.2.2 堿降解 以水溶性還原糖得率為指標，取1 g茶渣按1∶30 (g/mL)固液比降解。

(1) 分別用0.03，0.05，0.07，0.09，0.11 mol/L的氫氧化鈉降解，降解溫度均為80 ℃，降解時間均為90 min。

(2) 分別在60，70，80，90，100 ℃的溫度下，均用0.05 mol/L 氫氧化鈉降解，降解時間均為90 min。

(3) 分別降解1，2，3，4，5 h，均用0.05 mol/L氫氧化鈉降解，降解溫度均為80 ℃。

(4) 以氫氧化鈉濃度、降解溫度、降解時間為考察因子進行L9(33)正交試驗。

1.2.3 酸降解 以水溶性還原糖得率為指標，取1 g茶渣按1∶30 (g/mL)固液比降解。

(1) 分別用5%，7%，9%，11%，13%的硝酸降解，降解溫度均為85 ℃，降解時間均為90 min。

(2) 分別在60，70，80，90，100 ℃的溫度下，均用5%的硝酸降解，降解時間均為90 min。

(3) 分別降解0.5，1.0，1.5，2.0 h，均用5%的硝酸降解，降解溫度均為85 ℃。

(4) 將硝酸濃度、降解溫度、降解時間為考察因子進行L9(33)正交試驗。

1.2.4 輻照預處理+堿降解+酸降解 分別取1 g各劑量輻照后的茶渣，先按最佳堿降解工藝組合進行降解，再采用最佳酸降解工藝組合進行降解，檢測水溶性還原糖得率，獲得最優(yōu)輻照降解+堿降解+酸降解綠茶水提茶渣制備水溶性還原糖的工藝技術組合。

1.3 理化指標測定方法

1.3.1 茶渣纖維素測定 參照文獻[11]。

1.3.2 茶渣果膠測定 按GB/T 10742—2008的重量法執(zhí)行。

1.3.3 茶渣水溶性還原糖測定 參照文獻[12]。

1.3.4 茶渣中水分測定 按GB/T 8304—2013的120 ℃茶葉烘干法執(zhí)行。

1.3.5 水溶性還原糖得率計算 根據(jù)式(1)計算水溶性還原糖得率。

(1)

式中：

R——水溶性還原糖得率，%；

m——茶渣降解后濾液中的水溶性還原糖量，g；

M——茶渣的樣重，g；

W——試樣含水量，%。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對茶渣水溶性還原糖的影響

由圖1可知，輻照吸收量高于200 kGy時，輻照可降解茶渣生成水溶性糖，并且輻照吸收量越大，生成水溶性糖越多。輻照吸收量為1 000 kGy時，纖維素降解為水溶性糖后，發(fā)生分子內(nèi)脫水生成呋喃類物質(zhì)，因此水溶性糖得率偏低。輻照吸收量為1 200 kGy時，纖維素最大程度裂變降解，水溶性糖得率最高，為4.13%。由此可知在一定輻照劑量范圍內(nèi)，輻照劑量越大，得率越高，說明高能輻照能降低纖維素聚合度[13]，使大分子的纖維素降解為小分子物質(zhì)。

圖1 輻照后茶渣中水溶性還原糖得率

Figure 1 The yield of water-soluble reducing sugar in tea residue with irradiation absorption

2.2 堿降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

2.2.1 氫氧化鈉濃度對水溶性還原糖得率的影響 纖維素與氫氧化鈉形成Na-cellulose復合結構，在堿的水合離子作用下溶解[14]。由圖2可知，在氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L時，水溶性糖得率最高。隨濃度的增加，堿纖維吸附多余的氫氧化鈉，水溶性糖得率降低。當濃度為0.03 mol/L時，降解前與降解后的還原糖含量相同，說明濃度過低的氫氧化鈉無法達到降解茶渣效果，因此選用0.05，0.07，0.09 mol/L的氫氧化鈉溶液進行正交試驗。

圖2 氫氧化鈉濃度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 2 The effect of concentration of sodiun hydroxide on the yield of water-soluble reducing sugar

2.2.2 氫氧化鈉降解溫度對水溶性還原糖得率的影響 由圖3發(fā)現(xiàn)，溫度低于90 ℃，水溶性還原糖得率隨溫度的增高而增加；降解溫度高于90 ℃，產(chǎn)物糖與蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸發(fā)生美拉德反應，水溶性還原糖得率隨溫度的升高而降低。

2.2.3 氫氧化鈉降解時間對水溶性還原糖得率的影響 在圖4中，降解時間在1 h內(nèi)，隨降解時間的延長，水溶性還原糖得率增加。降低時間長于1 h，由于蛋白質(zhì)大部分溶于溶液[15]，與產(chǎn)物糖發(fā)生反應的機率增大，使水溶性糖減少。為減小蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的氨基酸對水溶性還原糖得率的影響，選用0.5，1.0，1.5 h進行正交試驗。降解時間超過2 h后，隨降解時間的延長，水溶性糖得率稍有增加。

圖3 氫氧化鈉降解溫度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 3 The effect of sodiun hydroxide degradation temperature on the yield of water-soluble reducing sugar

圖4 氫氧化鈉降解時間對水溶性還原糖得率的影響

Figure 4 The effect of sodiun hydroxide degradation time on the yield of water-soluble reducing sugar

2.2.4 氫氧化鈉降解的正交試驗 在單因素試驗基礎上，進行L9(33)正交試驗。正交試驗因素及水平見表1，正交試驗結果見表2。

由表2可知，各因子對水溶性還原糖影響的主次順序為氫氧化鈉濃度>降解時間>降解溫度，在最優(yōu)工藝技術組合下，即用0.05 mol/L的氫氧化鈉溶液于90 ℃降解1 h后，水溶性糖得率最高，為2.08%，說明堿可使纖維素分子發(fā)生潤漲降解[16]。

表1 氫氧化鈉降解的各因素正交試驗水平

Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of sodium hydroxide degradation

水平A 溫度/℃B 氫氧化鈉濃度/(mol·L-1)C 時間/h1800.050.52900.071.031000.091.5

表2 氫氧化鈉溶液降解的正交結果

Table 2 The result of orthogonal experiment of sodiun hydroxide degradation

試驗號ABC含量/%11111.9121221.8431331.8742122.0852231.8062312.0273131.9383211.8593322.01K11.871.981.93K21.971.831.98K31.931.971.87R0.100.150.11

2.3 酸降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

2.3.1 硝酸濃度對水溶性還原糖得率的影響 由圖5可知，硝酸降解濃度為9%時，水溶性還原糖得率最高。因為硝酸濃度低于9%時，硝酸濃度越高，則氫離子濃度越高，對纖維素結構的破壞力更強，水溶性還原糖得率增加；當濃度高于9%時，水溶性還原糖在硝酸作用下生成糠醛、有機酸等副產(chǎn)物，得率降低，且硝酸濃度太高，受熱分解產(chǎn)生的NO2增多，污染環(huán)境。

圖5 硝酸濃度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 5 The effect of the concentration of nitric acid on the yield of water-soluble reducing sugar

2.3.2 硝酸降解溫度對水溶性還原糖得率的影響 由圖6可知，溫度高于80 ℃的得率較高，當降解溫度低于80 ℃時，缺少足夠的能量使纖維素的氫鍵斷裂，水溶性還原糖得率明顯偏低。

圖6 硝酸降解溫度對水溶性還原糖得率的影響

Figure 6 The effect of nitric acid degradation temperature on the yield of water-soluble reducing sugar

2.3.3 硝酸降解時間對水溶性還原糖得率的影響 由圖7發(fā)現(xiàn)，隨降解時間的延長，纖維素降解率越高，還原糖得率越高。但纖維素降解的同時，伴隨著水溶性還原糖的降解，因此隨時間的延長，糖的增長速率減小。

2.3.4 硝酸降解的正交試驗 在單因素試驗基礎上，進行L9(33)正交試驗。正交試驗因素及水平見表3，正交試驗結果見表4。

由表4可知，各因子影響水溶性還原糖的主次順序為處理溫度>處理時間>硝酸濃度。最優(yōu)的工藝技術組合為9%硝酸在100 ℃下降解2 h，未出現(xiàn)在正交組合中，需進行驗證實驗。取茶渣按最優(yōu)條件降解，水溶性還原糖得率為(10.57±0.24)%，高于正交表中任一組合，符合正交分析結果。

2.4 輻照預處理+堿降解+酸降解綠茶渣制備水溶性還原糖的效果

由圖8可知，在不同方法組合降解中，輻照吸收量低于1 000 kGy 時，輻照吸收量越大，木質(zhì)素和半纖維素的降解率越大，從而水溶性還原糖得率越高。輻照吸收量為1 200 kGy 時，部分纖維素已降解成呋喃類物質(zhì)，剩余的纖維素經(jīng)過堿降解+酸降解，生成的水溶性還原糖偏少。輻照吸收量1 000 kGy時纖維素結構被充分破壞，且二次降解少，因此降解效果最優(yōu)。取輻照量為1 000 kGy的茶渣用最優(yōu)堿降解工藝降解，再用最優(yōu)酸降解工藝降解，進行3次平行試驗得水溶性還原糖得率為(13.18±0.14)%，說明不同方法組合降解效果最優(yōu)且方法穩(wěn)定。組合降解中，輻照降解破壞纖維素與木質(zhì)素、蛋白質(zhì)構成聚合液晶結構[17]，堿降解使纖維素分子發(fā)生潤漲，增大酸與纖維素接觸面。

圖7 硝酸降解時間對水溶性還原糖得率的影響

Figure 7 The effect of nitric acid degradation time on the yield of water-soluble reducing sugar

表3 硝酸降解的各因素正交試驗水平

表4 硝酸降解的正交試驗結果

比較圖1與圖8可知，組合降解明顯優(yōu)于單一降解。輻照后的茶渣經(jīng)過堿、酸降解后，水溶性還原糖得率明顯增加，說明輻照降解的機理與酸堿降解機理不同。組合降解效果的大小不是單一降解效果的簡單疊加，所以組合降解實際效果可能與理論效果不同。

圖8 輻照吸收量對不同方法組合降解水溶性

Figure 8 The effect of irradiation absorption dose on the yield of soluble reducing sugar with degradation of different method combination

3 結論

不同降解方法的水溶性還原糖得率由高到低依次為：不同方法組合降解>酸降解>輻照降解>堿降解。其中，輻照降解在輻照吸收量為1 200 kGy時降解效果最佳，為4.13%；堿降解的最佳工藝組合為用0.05 mol/L氫氧化鈉于90 ℃降解1 h，水溶性還原糖得率為2.08%；酸降解的最佳工藝組合為用9%硝酸于100 ℃降解2 h，水溶性還原糖得率為10.57%。將綠茶茶渣先進行1 000 kGy的輻照預處理，然后用0.05 mol/L的氫氧化鈉于90 ℃處理1 h，再用9%的硝酸于100 ℃處理2 h，水溶性還原糖得率可達13.18%，即采用1 000 kGy輻照預處理+最佳堿降解+最佳酸降解的組合工藝是利用綠茶茶渣制備水溶性還原糖的最優(yōu)工藝技術。