陳星星， 李 焰， 楊小燕， 楊守深， 林福新

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 福建 龍巖 364012 ； 2.福建省生豬疫病防控工程技術(shù)研究中心， 福建 龍巖 364012)

隨著畜禽疾病的復(fù)雜性和多樣性逐漸增加，養(yǎng)殖生產(chǎn)中為了防控疾病和提高生產(chǎn)性能，出現(xiàn)大量使用以抗生素為主的飼料添加劑、不合理免疫接種等問(wèn)題，導(dǎo)致畜產(chǎn)品藥物殘留、免疫功能下降、耐藥性增加，從而影響人類健康，同樣給我國(guó)畜牧業(yè)造成的損失日趨嚴(yán)重。中藥免疫增強(qiáng)劑由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成分多樣和具備內(nèi)在的多功能性，符合畜禽機(jī)體臟腑功能的相互協(xié)調(diào)和整體統(tǒng)一規(guī)律，能增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能和提高生產(chǎn)力，并且部分兼?zhèn)錉I(yíng)養(yǎng)性作用功能較全面[1]。帥起義等[2]研究表明，中藥免疫增強(qiáng)劑具有提升豬瘟疫苗免疫抗體的顯著作用，提高豬群生產(chǎn)性能，是預(yù)防免疫抑制疾病的重要手段。張桂枝等[3]結(jié)果表明，復(fù)方中藥免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)雛雞免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。耿文學(xué)等[4]以VA5免疫增強(qiáng)劑顯著提升豬偽狂犬病病毒滅活疫苗的免疫效果，對(duì)豬偽狂犬病滅活疫苗的免疫具有增強(qiáng)作用。

鐵皮石斛是我國(guó)名貴中藥，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，又名黑節(jié)草、鐵吊蘭等。味甘，平，無(wú)毒。主傷中，除痹，強(qiáng)陰。久服厚腸胃，輕身延年之功效[5]?，F(xiàn)代研究表明，其富含多糖、生物堿、微量元素和氨基酸等多種有效成分，主要有增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)消化、抗疲勞、抗肝損傷、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。脾臟是機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞聚集的部位[6]。而T、B淋巴細(xì)胞是機(jī)體的免疫活性細(xì)胞，其分裂、增殖在機(jī)體發(fā)揮免疫系統(tǒng)功能上有著重要的作用[7]。鐵皮石斛有補(bǔ)肝悅脾之功效，對(duì)免疫力也有提高作用。因此本試驗(yàn)研究鐵皮石斛對(duì)免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響，為將其開(kāi)發(fā)為畜禽免疫增強(qiáng)劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物配制 100 g鐵皮石斛脫水曬干枝條，藥材質(zhì)量符合中華人民共和國(guó)獸藥典(2005年版)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。采用傳統(tǒng)水煎法：蒸餾水預(yù)先浸泡2 h，加熱煎煮2次，第1次保持微沸30 min，過(guò)濾藥液；藥渣加溫水再煮沸，保持微沸30 min，過(guò)濾藥液；合并兩次濾液，小火濃縮至1.0 g/mL(按照生藥量計(jì)算)。于60目篩網(wǎng)過(guò)濾、裝瓶、高壓滅菌，于-20 ℃冰箱保存。

1.1.2 環(huán)磷酰胺的配制 將0.2 g環(huán)磷酰胺粉末與生理鹽水按100 mg/kg進(jìn)行稀釋。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)，購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清、二甲基亞砜(DMSO)、RPMI-1640培養(yǎng)基、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購(gòu)自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、氯化銨(NH4Cl)等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。青鏈霉素，?gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 主要設(shè)備 SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；T-DH型倒置顯微鏡，日本Nihon Kohden公司；3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 6周齡清潔級(jí)KM小鼠50只，體重18～22 g，全為雌性，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。隨機(jī)分為對(duì)照組、免疫抑制組，每組25只。每組各設(shè)5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只小鼠。對(duì)照組給予腹腔注射等量的生理鹽水，免疫抑制組給予腹腔注射環(huán)磷酰胺注射液(100 mg/kg·bw)。

對(duì)照組與免疫抑制組隔天分別注射生理鹽水和環(huán)磷酰胺注射液，1日1次，劑量為100 mg/kg·bw，連續(xù)15 d，末次給藥后取對(duì)照組和免疫抑制組的小鼠各2只，將小鼠空腹12 h之后，脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌取脾，放在盛有適量PBS的培養(yǎng)皿中，小心剪除脂肪與筋膜組織，置于200目篩網(wǎng)上，用無(wú)菌注射針針芯輕輕研磨，使細(xì)胞濾過(guò)篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，加入3 mL Tris-NH4Cl裂解紅細(xì)胞，室溫靜置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄去上清，用RPMI-1640培養(yǎng)液離心洗滌細(xì)胞2次，以除去剩余的Tris-NH4Cl。收集細(xì)胞懸液即為脾淋巴細(xì)胞。運(yùn)用臺(tái)盼藍(lán)染色統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力。

1.2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)

1.2.2.1 鐵皮石斛對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用最佳濃度及最佳時(shí)間的選擇 顯微鏡計(jì)數(shù)，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞稀釋成2×106個(gè)/mL，分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，加入不同濃度的鐵皮石斛，最終體積均為200 μL/孔，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。然后向每孔加入10 μL MTT反應(yīng)4 h，棄上清，再向各孔加入150 μL DMSO，混勻，靜置5 min，最后酶標(biāo)儀測(cè)定OD570mm值。

1.2.2.2 鐵皮石斛于體外對(duì)ConA/LPS介導(dǎo)的小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖的影響 分別將小鼠脾細(xì)胞懸液按照100 μL/孔加入到96孔板中。各樣本設(shè)ConA孔、LPS孔、對(duì)照孔。ConA孔加入2 μL ConA(最終濃度為10 μg/mL)，LPS孔加入2 μL LPS(最終濃度為100 μg/mL)，對(duì)照孔不加入鐵皮石斛，最終體積均為200 μL/孔。按照1.2.2.1方法培養(yǎng)細(xì)胞，MTT法測(cè)定各培養(yǎng)孔OD570mm值。

1.2.3 細(xì)胞增殖測(cè)定方法 采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，即在二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)44 h后，每孔加入10 μL的MTT，繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，吸棄上清，最后加入DMSO 150 μL/孔，混勻，靜置5 min，于570nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Duncan′s多重比較及配對(duì)樣本t檢驗(yàn)(置信區(qū)間95%)，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，以P<0.05為差異顯著，P>0.05表明數(shù)據(jù)差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表1可知，不同作用濃度分析表明，鐵皮石斛在終質(zhì)量濃度5～405 μg/mL范圍內(nèi)均可促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，并且表現(xiàn)量效關(guān)系，其中在5～135 μg/mL范圍內(nèi)促進(jìn)效果顯著(P<0.05)。不同作用時(shí)間分析表明，在不同濃度鐵皮石斛刺激24、48、72 h 后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞均有增殖，其中作用48 h增殖幅度最大，表明鐵皮石斛作用48 h對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖效果顯著(P<0.05)。

表1 鐵皮石斛對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用最佳濃度及最佳時(shí)間的選擇

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，有相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05),下表同

2.2 不同濃度鐵皮石斛對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表2可知，培養(yǎng)48 h后，對(duì)于免疫抑制組而言，在濃度為20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL的鐵皮石斛協(xié)同ConA刺激免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分裂增殖情況具有顯著作用(P<0.05)，其中鐵皮石斛濃度在20 μg/mL時(shí)最佳。從對(duì)照組來(lái)看，20 μg/mL鐵皮石斛濃度與單純ConA刺激正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖效果差異不顯著(P>0.05)。對(duì)照組中，不同濃度的鐵皮石斛組間進(jìn)行比較，各組間均差異顯著(P<0.05)，并在一定濃度范圍內(nèi)，隨鐵皮石斛濃度的增高，細(xì)胞分裂增殖效果有增加趨勢(shì)。

表2 不同濃度鐵皮石斛對(duì)免疫抑制、對(duì)照小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.3 不同濃度鐵皮石斛對(duì)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響 由表3可知，培養(yǎng)48 h后，對(duì)于免疫抑制組而言，不同濃度的鐵皮石斛+LPS組與LPS組單純刺激相比差異顯著(P<0.05)，各濃度鐵皮石斛OD值均高于單純LPS刺激。提示在體外培養(yǎng)條件下鐵皮石斛能很好的協(xié)同LPS刺激免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖，以40 μg/mL濃度效果最佳。對(duì)于對(duì)照組而言，不同濃度的鐵皮石斛進(jìn)行組間比較，各組間均差異不顯著(P>0.05)，不同濃度的鐵皮石斛對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞分裂增殖效果顯著(P<0.05)。

表3 不同濃度鐵皮石斛對(duì)免疫抑制、對(duì)照小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖的影響

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)參考文獻(xiàn)和預(yù)試驗(yàn)選擇以100 mg/kg·bw，腹腔注射環(huán)磷酰胺，一日一次，隔天注射，連續(xù)15 d的方法建立免疫抑制模型小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體重減輕、飲食減少、精神沉郁、行動(dòng)遲緩等免疫抑制癥狀，與李焰等[8]報(bào)道相符。表明免疫抑制模型小鼠建立成功。

脾臟是體內(nèi)最大的外周淋巴器官，含有大量的淋巴細(xì)胞，其中T淋巴細(xì)胞占35%～50%，B淋巴細(xì)胞占50%～65%，兩者分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞的增殖情況能直觀的反映出機(jī)體免疫功能[9]。Con A 、LPS分別作為T 、B淋巴細(xì)胞的有絲分裂原，主要促進(jìn)兩者增殖與分化為淋巴母細(xì)胞，最終產(chǎn)生相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。本試驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞的分裂增殖情況，MTT法于1983年首創(chuàng)，由Mosmann應(yīng)用于鼠淋巴瘤細(xì)胞中研究IL-2等細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞存活和增殖的影響，MTT法具有重復(fù)性好、靈敏性高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。胡庭俊等[12]運(yùn)用MTT法測(cè)定細(xì)胞的增殖程度，研究發(fā)現(xiàn)，山豆根多糖能夠促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌NO的作用。劉民等[13]在37 ℃培養(yǎng)條件下用MTT法檢測(cè)小鼠淋巴細(xì)胞增殖。

本次試驗(yàn)選取5個(gè)濃度梯度在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下觀察鐵皮石斛對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響，由試驗(yàn)結(jié)果可知，鐵皮石斛終質(zhì)量濃度在5～135 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞增殖作用顯著(P<0.05)。作用48 h效果最為明顯。因此本試驗(yàn)選取20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL三個(gè)濃度作為探討鐵皮石斛協(xié)同ConA、LPS刺激小鼠脾臟T、B淋巴細(xì)胞體外作用的最佳濃度。對(duì)于小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞而言，3個(gè)鐵皮石斛濃度均能促進(jìn)免疫抑制組小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05)，其中濃度為20 μg/mL時(shí)，小鼠淋巴細(xì)胞的增值效果最佳，表明鐵皮石斛能夠協(xié)同ConA促進(jìn)免疫抑制小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。對(duì)照組中，不同濃度的鐵皮石斛組間進(jìn)行比較，各組間均差異顯著(P<0.05)，并在一定濃度范圍內(nèi)，隨鐵皮石斛濃度的增高，細(xì)胞分裂增殖效果有增加趨勢(shì)，鐵皮石斛濃度為80 μg/mL時(shí)對(duì)于正常小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞分裂增殖顯著(P<0.05)。對(duì)于小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞而言，鐵皮石斛濃度為40 μg/mL時(shí)對(duì)免疫抑制小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖效果最佳。各濃度鐵皮石斛OD值均高于單純LPS刺激，且細(xì)胞增殖情況差異顯著(P<0.05)，但對(duì)照組中三個(gè)鐵皮石斛濃度差異不顯著(P>0.05)。提示鐵皮石斛協(xié)同LPS促進(jìn)正常小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞增殖，參與機(jī)體體液免疫，但最佳濃度還有待進(jìn)一步的研究。

夏方等[14]研究發(fā)現(xiàn)是由地錦草、白頭翁和黃連3味中藥組方制成的地翁顆粒能促進(jìn)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖。宋美芳等[15]研究結(jié)果表明，鐵皮石斛多糖在一定的濃度范圍內(nèi)能提高小鼠的免疫活性，促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌。以上學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)為本次試驗(yàn)結(jié)果提供有力的佐證。

綜上所述，在體外培養(yǎng)條件下，鐵皮石斛協(xié)同LPS、ConA促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞增殖，加強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，為鐵皮石斛的開(kāi)發(fā)成畜禽免疫增強(qiáng)劑提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。