王少杰， 巴 娟， 張勇軍， 鄧 樺， 蒲文珺， 楊 鴻

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 佛山 528231)

中藥多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗應(yīng)激、抗病毒等廣泛的生物學(xué)活性，已在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，也是新獸藥研究的熱點(diǎn)。玉屏風(fēng)散出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，是中醫(yī)扶正固本的代表方劑，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味藥物組成，YPF-P為玉屏風(fēng)散的有效部位群，研究表明,玉屏風(fēng)散及其多糖對(duì)免疫系統(tǒng)有廣泛的調(diào)節(jié)作用[1-3]，在獸醫(yī)臨床有較好的應(yīng)用前景。

目前獸用中藥多糖的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不完善，往往僅檢測(cè)總糖含量，致使一些假、劣的多糖產(chǎn)品屢屢出現(xiàn)。多糖所具有的藥理活性及其單糖組成是密切相關(guān)的，因此在檢測(cè)總糖含量時(shí)還需對(duì)其單糖組成進(jìn)行定性分析[4-7]。由于多糖和單糖都不具有紫外吸收，無(wú)法直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)定[8]，因此本試驗(yàn)先對(duì)YPF-P進(jìn)行水解和衍生化處理，再采用高效液相色譜法(HPLC)分析其單糖組成及其物質(zhì)量比，為YPF-P質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的制定進(jìn)行探索性研究，也為獸用中藥多糖的質(zhì)量控制研究提供借鑒。

1 材料

1.1 藥品 中藥黃芪、白術(shù)、防風(fēng)，購(gòu)自北京同仁堂藥店佛山分店；D-甘露糖(批號(hào)：140651-201403)、鼠李糖(批號(hào)：111683-201502)、D-核糖(批號(hào)：140668-201302)、D-半乳糖醛酸(批號(hào)：111646-200301)、阿拉伯糖(批號(hào)：1506-200001)。對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-葡萄糖(批號(hào)：201705)，D-半乳糖(批號(hào)：201705)對(duì)照品，購(gòu)自上海瑞楚生物科技有限公司。

1.2 試劑 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸(TFA)、硫酸、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純。

1.3 儀器 島津LC-20A高效液相色譜儀；雷磁PHS-3C pH計(jì)；LABCONCO FreeZone?真空冷凍干燥機(jī)；湘儀H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)；UV-6000型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)；HH-8恒溫水浴鍋；予華RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

2 方法

2.1 YPF-P的制備及含量測(cè)定[9]將黃芪、白術(shù)、防風(fēng)按3∶1∶1的質(zhì)量配方。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，將提取的粗多糖經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化濃縮，真空冷凍干燥即得精制多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。

2.2 YPF-P水解 稱(chēng)取50 mg精制多糖兩份，置于兩個(gè)10 mL密封試管中加入2 mol/L的TFA溶液2 mL,97 ℃水浴8 h，水解結(jié)束放涼后用4 mol/L NaOH溶液中和至中性，離心取上清即得。

2.3 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品與YPF-P水解樣品的衍生化 分別稱(chēng)取D-甘露糖、鼠李糖、D-葡萄糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、阿拉伯糖對(duì)照品各5 mg，定容于25 mL容量瓶中即得混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品。取該溶液100 μL與0.5 mol/L PMP 甲醇溶液50 μL及0.3 mol/L NaOH 溶液50 μL混合，充分振搖，水浴條件下反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl 50 μL進(jìn)行中和，加入1 mL 氯仿萃取，離心，棄去有機(jī)層，重復(fù)萃取3 次，得上層水液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，備用[10]。取精制YPF-P水解樣品100 μL采用同樣的方法進(jìn)行衍生化處理即得。

2.4 色譜條件與專(zhuān)屬性試驗(yàn) 色譜柱：Wondasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液(pH值6.9)-乙腈(85∶15)；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，各色譜峰得到良好的分離。

2.5 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：取混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，衍生化后連續(xù)進(jìn)樣6次，以峰面積的RSD值考察儀器精密度；重復(fù)性試驗(yàn)：取YPF-P的衍生化產(chǎn)物連續(xù)6次進(jìn)樣測(cè)定；穩(wěn)定性試驗(yàn)：取YPF-P的衍生化產(chǎn)物分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣。回收率試驗(yàn)：在樣品中添加相當(dāng)于樣品含量一半的100%、120%和150%混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品，配成3個(gè)質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)行測(cè)定。

2.6 線(xiàn)性考察 混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、10 μL，用峰面積對(duì)各單糖的質(zhì)量濃度回歸。

2.7 各單糖的物質(zhì)的量比[11]計(jì)算方法：按式(1)、(2)計(jì)算其中兩種單糖間的校正因子f1/2和樣品中這兩種單糖的比例R1/2。

f1/2=(A2/m2)/(A1/m1)

(1)

A1、A2 分別為混合對(duì)照品溶液中單糖1、2 的峰面積，m1、m2 分別為混合對(duì)照品溶液中單糖1、2 的質(zhì)量濃度。

(2)

3 結(jié)果

3.1 YPF-P制備和含量測(cè)定 最佳提取條件為：料液比1∶16、浸提時(shí)間1.5 h、浸提溫度90 ℃、提取次數(shù)3次，之后抽濾、濃縮提取液，無(wú)水乙醇沉淀濃縮液12 h，取沉淀物經(jīng)真空干燥，得玉屏風(fēng)復(fù)合粗多糖。經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂純化的YPF-P含量可達(dá)93%以上。

3.2 方法學(xué)考察 精密度試驗(yàn)：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為1.13%、0.90%、0.49%、0.70%、0.57%、1.53%、1.52%。

重復(fù)性試驗(yàn)：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的RSD值分別為0.65%、1.36%、1.39%、1.21%、1.20%、1.12%、0.60%。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為0.73%、0.78%、1.10%、0.89%、1.17%、1.11%、0.70%。表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

回收率試驗(yàn)：計(jì)算得D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為101.4%，98.9%，99.7%，98.7%，98.3%，114.4%，110.0%；RSD值為0.29%，0.24%，0.20%，0.92%，0.41%，0.72%，1.86%。

3.3 線(xiàn)性考察 用峰面積對(duì)混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品中各單糖的質(zhì)量濃度回歸，線(xiàn)性結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程

3.4 單糖對(duì)照品與YPF-P的HPLC分析色譜圖 將混合單糖對(duì)照品溶液與YPF-P水解產(chǎn)物分別衍生化后進(jìn)行HPLC分析，通過(guò)單糖對(duì)照品圖譜得出結(jié)果：D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的衍生化物分別在24.27、29.68、33.29、36.96、47.28、52.52、56.64 min左右出現(xiàn)吸收峰，見(jiàn)圖1；對(duì)比YPF-P圖譜，在相同的位置也出現(xiàn)的對(duì)應(yīng)吸收峰，只是峰的大小有所不同?？梢源_定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7種單糖組成，見(jiàn)圖2。

圖1 單糖對(duì)照品溶液HPLC色譜圖

1:D-甘露糖； 2:D-核糖； 3:鼠李糖； 4:D-半乳糖醛酸；5:D-葡萄糖； 6:D-半乳糖； 7:阿拉伯糖

圖2 YPF-PHPLC色譜圖

1：D-甘露糖； 2：D-核糖； 3：鼠李糖； 4：D-半乳糖醛酸；5：D-葡萄糖； 6：D-半乳糖； 7：阿拉伯糖

3.5 YPF-P中各單糖的物質(zhì)的量比 通過(guò)計(jì)算得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質(zhì)的量比為4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，見(jiàn)表2。

表2 YPF-P中各單糖的物質(zhì)的量比計(jì)算結(jié)果

4 討論

開(kāi)展獸用中藥多糖質(zhì)量控制的研究，制定國(guó)家或行業(yè)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，是創(chuàng)制新型多糖藥物或飼料添加劑的重要前提。由于多糖分子量相對(duì)較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，使多糖的定性和定量檢測(cè)成為多糖類(lèi)新藥研發(fā)中的瓶頸問(wèn)題。多糖的常規(guī)分離法包括提取、除脂、脫色、除蛋白、醇柱分離純化、透析等基本步驟[12]，處理過(guò)程繁瑣復(fù)雜。本試驗(yàn)采用AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)粗多糖溶液進(jìn)行分離，提高了分離效率；采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法分析其單糖組成及其物質(zhì)量比，解決了多糖和單糖不具有紫外線(xiàn)吸收，無(wú)法直接對(duì)其進(jìn)行測(cè)定的問(wèn)題。試驗(yàn)旨在開(kāi)展YPF-P的質(zhì)量控制研究，摸索出快捷、有效質(zhì)控方法，為YPF-P新獸用制劑的創(chuàng)制提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為多糖質(zhì)量控制方法研究提供參考和借鑒。

試驗(yàn)采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化水提醇沉淀的提取工藝，經(jīng)AB-8大孔樹(shù)脂對(duì)玉屏風(fēng)粗多糖進(jìn)行純化，使得YPF-P的含量達(dá)到93%以上。

對(duì)比單糖混合對(duì)照品圖譜與YPF-P圖譜(見(jiàn)圖1、2)，可以確定YPF-P由D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖7種單糖組成。研究表明，在單糖組成的定量分析中，采用只求單糖間的物質(zhì)的量比的方法，而并不需要確定各單糖的具體質(zhì)量[13]。本試驗(yàn)得出YPF-P中D-甘露糖、D-核糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、阿拉伯糖的物質(zhì)的量比為4.64∶1∶5.88∶2.40∶120∶42.9∶69.5，明確了多糖中各單糖的組分，該結(jié)果對(duì)YPF-P質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定有重要意義。

在用高效液相色譜法分析多糖組成及其含量時(shí)，一般采用凝膠色譜柱與示差折光檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等儀器，這些方法不僅靈敏度低、基線(xiàn)噪音大、柱溫對(duì)結(jié)果影響較大、測(cè)定過(guò)程中易發(fā)生單糖轉(zhuǎn)化并且這些儀器與色譜柱價(jià)格高昂。本試驗(yàn)首次對(duì)方劑復(fù)合多糖進(jìn)行單糖組成測(cè)定，建立的PMP柱前衍生化-高效液相色譜法分析YPF-P的方法靈敏度高、樣品用量少、穩(wěn)定性好、方法準(zhǔn)確可靠，能夠很好地分離測(cè)定YPF-P的各單糖組分。