陸亞冬， 劉賢俠， 陳創(chuàng)夫

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院， 新疆 石河子 832003)

輪狀病毒(Rotavirus,RV)是引起嬰幼兒和多種幼齡動物腹瀉的主要病原之一。給人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來極大的損失，依據(jù)輪狀病毒自身的特有的抗原性和PAGE膠上輪狀病毒RNA片段電泳的遷移率，其血清型分為A、B、C、D、E和F共 6個(gè)組，A組在人類和動物病毒株中甚是普遍[1]。

RV為無囊膜球形病毒，A群RV為有11個(gè)基因片段的雙股RNA病毒，基因組編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。其中內(nèi)衣殼蛋白VP6由第6節(jié)段基因編碼，由397個(gè)氨基酸組成，大小為45 kD，該蛋白是基因組的核心蛋白，約占病毒蛋白量的51%。輪狀病毒粒子為3層衣殼結(jié)構(gòu)，外層衣殼由VP7和VP4蛋白構(gòu)成病毒衣殼中間層由VP6組成，最內(nèi)層由VP2、VP3和VP1組成，VP6蛋白不但在病毒的復(fù)制和裝配中發(fā)揮重要的作用[3-9]，也是A群RV的群特異性抗原。VP6具有較高的免疫反應(yīng)性和抗原性，是介導(dǎo)其特異性免疫反應(yīng)黏膜免疫的特異性抗原[10～14]。而牛輪狀病毒是輪狀病毒屬的一種，牛輪狀病毒是引起新生犢牛腹瀉的主要病原之一，該病在生產(chǎn)實(shí)踐中極為普遍，常和其他病原混合感染，本研究基于新疆地區(qū)規(guī)?；龅默F(xiàn)狀，為解決規(guī)模化牛場中致犢牛腹瀉病原的快速診斷問題，為后續(xù)的間接ELISA試驗(yàn)、免疫膠體金試紙條制備試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體E.coliDH 5α 菌株、BL21(DE3)菌株和原核表達(dá)載體pET-32a菌株均由石河子大學(xué)動物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T載體,購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 酶標(biāo)儀、牛輪狀病毒抗原檢測試劑盒，購自上海潤裕公司； IPTG購自Merk公司；限制性內(nèi)切酶(EcoRI/HindIII)、T4連接酶、蛋白酶抑制劑、DNA Marker，購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)、Protease Inhibitor Cocktail、Ni-Agarose Resin，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗牛IgG、廣譜彩虹預(yù)染Marker，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 樣本的采集 從新疆北疆地區(qū)的142團(tuán)、143團(tuán)、148團(tuán)、塔城地區(qū)163團(tuán)、克拉瑪依市、奎屯、沙灣、石河子、呼圖壁、吉木薩爾縣、新疆奇臺縣等地區(qū)規(guī)?；膛龊筒糠秩馀霾杉篂a犢牛糞便樣品共172余份，保存-80 ℃冰箱待檢。

1.4 方法

1.4.1 腹瀉犢牛糞便的處理 用液氮在研缽中研磨糞便，將糞便與對應(yīng)體積的PBS于冰上充分研磨，進(jìn)行超聲破碎，進(jìn)行反復(fù)凍融，最后勻漿液于12 000 r/min離心30 min，取上清用牛輪狀病毒抗原用ELISA試劑盒進(jìn)行檢測。

1.4.2 牛輪狀病毒抗原檢測ELISA試劑盒 試劑盒原理是雙抗體夾心法，將處理好的樣品上清液吸取200 μL加入已經(jīng)預(yù)先包被牛輪狀病毒捕獲抗體的微孔中，同時(shí)設(shè)置陰陽性對照孔和空白孔，除空白孔外，樣品孔中加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100 μL，微量震蕩儀器上進(jìn)行震蕩混勻，用封板膜封好后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用1 h，取出棄掉微孔中的液體，每孔用洗滌液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用終止液進(jìn)行終止，在450 nm的酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)，初步鑒定并收集陽性病料。

1.4.3 目的基因擴(kuò)增與測序 根據(jù)GenBank中牛輪狀病毒VP6基因序列(登錄號：AF317127)，運(yùn)用Primer5.0軟件對基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。該基因序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，見表1。

表1 牛輪狀病毒VP6引物

以牛輪狀病毒陽性病料提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20 μL；2XEsTaqMaster mix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃后延伸10 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，同時(shí)瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段。

將回收的目的片段與pMD19-T載體在16 ℃水浴鍋中過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-VP6。連接體系20 μL：目的基因片段12 μL，pMD19-T載體3 μL，T4DNA Ligase Buffer 3 μL，T4DNA ligase 2.0 μL。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在有抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選陽性克隆，經(jīng)菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，并將提取的質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.4.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 用EcoRI和HindIII對測序正確的菌株的質(zhì)粒以及pET-32a載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段以及酶切后的線性pET-32a載體，并將目的片段分別和線性pET-32a在連接酶的作用下16 ℃水浴過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切鑒定。將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21中。

1.4.5 重組蛋白表達(dá)及表達(dá)條件優(yōu)化 將篩選出的陽性克隆菌再轉(zhuǎn)入LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min 培養(yǎng)2 h，使得其OD值0.4～0.6。通過調(diào)整誘導(dǎo)劑的濃度，在不同的誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)并收集菌體。取1 mL菌液離心棄上清，加入20 μL的5×SDS蛋白上樣液和80 μL的滅菌水進(jìn)行混合，震蕩混勻后沸水煮5 min，取15 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色和冰乙酸進(jìn)行脫色，觀察。

1.4.6 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定 對重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，超聲30 min，12 000 r/min離心分離上清和沉淀，運(yùn)用SDS-PAGE電泳檢查進(jìn)行分析重組表達(dá)蛋白在上清和包涵體的鑒定。

1.4.7 重組蛋白的純化 可溶性蛋白純化緩沖液配方。

表2 可溶性蛋白純化緩沖液配方

將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 min，待凝膠與溶液分層后， 把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

7His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白) 進(jìn)行純化， 咪唑洗脫后目的蛋白的純度。收集菌體后，每100 mg菌體(濕重)加入1 mL細(xì)菌裂解液(每1 mL細(xì)菌抽提試劑 中已加入10 μL蛋白酶抑制劑混合物)，超聲裂解菌體。超聲過程中保持菌液處于冰浴中，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱，短時(shí)間，多次超聲，通過一定的間隔時(shí)間避免溶液過熱，最終菌液變清即可。10 000 r/min(4 ℃)離心3 min，收集上清中的可溶性蛋白。用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液，使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。使用適量Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。洗脫峰可以分管收集，每1 mL收集1管，收集洗脫峰。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)散裝Ni2+柱進(jìn)行親和層析分離純化，在500 mmol/L咪唑洗脫液中收集得到的目的蛋白。洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡 (乙醇要將填料浸沒)，封柱后2 ℃～8 ℃保存。

1.4.8 Western Blotting 檢測重組蛋白VP6 對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至NC膜上，用190 mA的電流轉(zhuǎn)膜50 min，將膜放入預(yù)先用TBST洗滌后的雜交瓶中，37 ℃封閉2 h，用TBST洗滌2次，每次5 min。加入1∶4 000的稀釋的牛輪狀病毒陽性血清，37 ℃孵育2 h后用TBST洗滌2次，每次5 min，加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗牛IgG，37 ℃孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。進(jìn)行顯色，進(jìn)行拍照處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增和序列測定 PCR擴(kuò)增BRV VP6片段大小為1194 bp，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，與預(yù)期的大小一致，如圖1。測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列比對后同源性100%。

2.2 VP6基因的表達(dá)載體的構(gòu)建及其酶切鑒定結(jié)果 用EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，表明目的基因BRV VP6基因已經(jīng)成功插入到表達(dá)載體中，如圖2。

2.3 重組蛋白VP6-32a-DE3的誘導(dǎo)表達(dá)圖 誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白表達(dá)結(jié)果與預(yù)期理論值60 kDa大小相符，如中插彩版圖3。

2.4 重組蛋白VP6-32a-DE3上清/包涵體鑒定 SDS-PAGE電泳檢測分析表明，重組表達(dá)蛋白質(zhì)在上清和包涵體都有表達(dá)，如中插彩版圖4。

圖1 VP6基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pET32a-VP6質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.5 重組蛋白VP6-32a-DE3的純化 10His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白) 純化結(jié)果，如中插彩版圖5。

2.6 重組蛋白VP6-32a-DE3 Western Blot鑒定 純化的重組蛋白VP6-32a-DE3 Western Blot鑒定，如中插彩版圖6。

3 討論

本研究表達(dá)的牛輪狀病毒重組蛋白BRV-VP6-32a-DE3蛋白經(jīng)15%SDS-PAGE分析，重組蛋白以包涵體和上清形式均有存在。經(jīng)誘導(dǎo)后重組菌裂解其上清和沉淀以及重組蛋白經(jīng)親和層析后，Western Blot分析顯示出單一的目的條帶，約60 kDa。

RV是無囊膜的雙鏈RNA病毒，20面體結(jié)構(gòu)，屬于呼腸孤病毒科成員，外部衣殼、內(nèi)部衣殼和核心衣殼3層組成，結(jié)構(gòu)蛋白VP6位于衣殼結(jié)構(gòu)的中間層，在病毒粒子的形成中起著重要的作用[15]，雙股RNA作為病毒體的核心，由11個(gè)不連續(xù)的片段組成，編碼VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7 6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5/NSP6 六個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。VP6蛋白的多肽折疊成2個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)蛋白VP6位于分子的基部，并維持病毒的結(jié)構(gòu)。從疏水性蛋白方面、病毒分組的特異性抗原方面和病毒株的分離鑒定上，VP6具有很強(qiáng)的抗原性和免疫原性，是診斷性試驗(yàn)中檢測到的主要抗原，是介導(dǎo)RV特異性免疫反應(yīng)的-黏膜免疫的主要抗原[16]。 Kohli E等[14]研究得到高效價(jià)的抗體，表明單克隆抗體與VP6蛋白的反應(yīng)性以及用肽掃描連續(xù)7個(gè)肽，確定A群VP6蛋白含有群特異抗原表位。第6基因編碼的內(nèi)衣殼蛋白，VP6含有基因組的蛋白核心，占病毒蛋白量的51%，因其基因序列在各毒株間比較保守，它在病毒的復(fù)制裝配中起著重要的作用。周芳等研究表明，在牦牛輪狀病毒VP6基因序列分析及RT-PCR中所建立的檢測方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性[17]，只擴(kuò)增出牦牛RV及BRV的特異性片段[18]。

牛腹瀉是養(yǎng)牛生產(chǎn)中極為常見的疾病，尤其是初生犢牛腹瀉更是極為棘手的問題，不僅造成了生產(chǎn)效率的低下，而且浪費(fèi)了大量的人力、物力和財(cái)力。同時(shí)又因不同疾病在臨床上導(dǎo)致的犢牛腹瀉的癥狀類似不容易鑒別，為此迫切需要建立一種快速、便捷、易于操作的診斷試劑，本試驗(yàn)通過對內(nèi)衣殼蛋白VP6基因的克隆、原核表達(dá)，為VP6作為診斷抗原開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。