沈 曉， 王爾松

復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 201508

多體素氫質(zhì)子磁共振波譜(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)是一項(xiàng)無創(chuàng)性獲取活體組織細(xì)胞代謝及生化信息的技術(shù)，通過測定腦組織及腫瘤內(nèi)代謝物濃度及比值的變化可實(shí)現(xiàn)對病變的定性與定量診斷。本研究分析了腦膠質(zhì)瘤1H-MRS代謝參數(shù)與病理金標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)性，為臨床利用1H-MRS確定膠質(zhì)瘤級別、了解膠質(zhì)瘤的代謝情況及指導(dǎo)最大安全范圍全切除膠質(zhì)瘤提供參考[1-2]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2014年10月入住復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院的膠質(zhì)瘤患者18例，所有患者未接受過開顱手術(shù)或放、化療。其中，男性12例，女性6例；年齡21～69歲，平均(40.3±15.3)歲。腫瘤主體位于額葉11例，顳葉2例，頂葉2例，島葉、基底節(jié)及丘腦各1例，腫瘤體積24.0～62.3 cm3。臨床表現(xiàn)：肢體乏力11例，言語功能障礙6例，嗜睡、頭痛4例。最終手術(shù)全切除11例，次全切除5例，僅行活檢2例。

1.2 常規(guī)磁共振成像及波譜檢查 術(shù)前1～2 d采用3.0 T磁共振(Siemens Magnetom Verio)，8通道頭部線圈。對比劑為釓噴酸葡胺(0.1 mmol/kg，GE Healthcare，Ireland)。常規(guī)磁共振掃描參數(shù)和序列：矢狀為T1W-FLAIR(TR/TE/TI 2 000/9/860 ms)，橫斷面TSE(TR/TE 6 000～7 540/95～98 ms)，橫斷面T1W-FLAIR(TR/TE/TI 2 000/9/860 ms)，橫斷面T2W-FLAIR(TR/TE/TI 8 500/94/2 440 ms)，橫斷面GRE序列(TR/TE 2 000/9 ms)。根據(jù)膠質(zhì)瘤是否強(qiáng)化，導(dǎo)航采用MPRAGE(TR/TE/TI 1 900/2.94 /900 ms，F(xiàn)OV 250 mm×250 mm，層厚1 mm，176層)或TSE(TR/TE 3 200/332 ms , FOV 250 mm×250 mm，層厚2.0 mm，64層)。1H-MRS采用多體素點(diǎn)分辨波譜成像序列(pointed-resolved spectroscopy sequence, PRESS)，參數(shù)如下：TR/TE 1 700/135 ms，層厚15 mm，PES 16×16 , FOV 120 mm×120 mm。在PRESS序列激發(fā)前，應(yīng)用CHESS序列抑制水峰。波譜檢查用T2W顯示膠質(zhì)瘤最大徑層面。感興趣區(qū)包含膠質(zhì)瘤增強(qiáng)區(qū)或T2W顯示的異常信號(hào)區(qū)、腫瘤周圍區(qū)域及對側(cè)正常腦組織。同時(shí)避免來自頭皮脂肪及顱骨脂質(zhì)的污染，應(yīng)用飽和帶減少化學(xué)位移產(chǎn)生的偽影，體素大小為7.5×7.5×15 mm3。波譜信號(hào)采集約需9 min，原始數(shù)據(jù)及解剖參考圖導(dǎo)入Syngo MultiModality工作站。

1.3 圖像與數(shù)據(jù)分析 各體素的1H-MRS參數(shù)數(shù)值在工作站由磁共振自帶軟件Spectroscopy計(jì)算獲得。通過擬合曲線獲取感興趣區(qū)代謝物的空間分布，在單個(gè)體素基礎(chǔ)上評估體素參數(shù)(高度、寬度、面積)。在解剖圖上疊加網(wǎng)格可以顯示每個(gè)體素的解剖部位。網(wǎng)格由256 (16×16)個(gè)體素組成，每個(gè)體素按序分配1個(gè)編號(hào)。

1.4 選擇與標(biāo)記穿刺靶點(diǎn) 術(shù)前采集MRS原始數(shù)據(jù)和導(dǎo)航數(shù)據(jù)后均導(dǎo)入MAC Pro計(jì)算機(jī)中，根據(jù)MRS參數(shù)特征及常規(guī)磁共振圖像，分別在腫瘤核心區(qū)及腫瘤周邊區(qū)域連續(xù)選取5個(gè)左右穿刺靶點(diǎn)。靶點(diǎn)盡可能位于一直線上，且盡量避開功能區(qū)、傳導(dǎo)束及較大腦血管；由于高級別膠質(zhì)瘤中心嚴(yán)重壞死或被破壞，對于波譜定量影響較大，亦酌情予以避開。完成設(shè)計(jì)穿刺軌跡后，記錄每個(gè)活檢靶點(diǎn)的編號(hào)，并在導(dǎo)航影像中標(biāo)記備用。其中，腫瘤核心區(qū)界定為膠質(zhì)瘤的強(qiáng)化區(qū)或T2高信號(hào)區(qū)，與腫瘤核心區(qū)1個(gè)體素距離的范圍界定為近瘤周，其余均定義為遠(yuǎn)瘤周。

1.5 組織活檢 將標(biāo)記好靶點(diǎn)的導(dǎo)航數(shù)據(jù)傳至導(dǎo)航系統(tǒng)工作站，根據(jù)手術(shù)計(jì)劃在導(dǎo)航系統(tǒng)軟件上將其與其他影像序列進(jìn)行融合。所有穿刺操作由同一名高年資神經(jīng)外科主治醫(yī)師完成。所有病例均在開顱手術(shù)前行導(dǎo)航下穿刺取材，以使所選取的體素與實(shí)際留取的組織標(biāo)本精確匹配。穿刺術(shù)中應(yīng)盡量使取材組織的解剖位置及體積與相應(yīng)體素吻合，組織樣本可在靶點(diǎn)4個(gè)方向上抽吸獲取，抽吸后保留穿刺針3～5 min，確保穿刺后無活動(dòng)性出血。

1.6 標(biāo)本處理 18例患者術(shù)中平均穿刺5個(gè)活檢靶點(diǎn)，最終獲取89個(gè)標(biāo)本。所有活檢標(biāo)本經(jīng)4%甲醛溶液固定后進(jìn)行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(H-E)染色。應(yīng)用EnVision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所用一抗如下：CD34(Dako, 單克隆；1∶200)， 神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP，Dako, 克隆6F2, 單克??；1∶200)，單克隆抗體(MIB-1，Dako, 克隆MIB-1, 單克隆；1∶200)。H-E和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2位神經(jīng)病理專科醫(yī)師根據(jù)2007年第4版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤》分類標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行診斷，對于形態(tài)和分級有爭論的病例經(jīng)討論后達(dá)成一致意見。

1.7 免疫組織化學(xué)染色分析 (1)細(xì)胞密度：對蘇木精襯染細(xì)胞核的切片隨機(jī)取5個(gè)(×200)。GFAP陽性的細(xì)胞標(biāo)記為腫瘤細(xì)胞，同一視野內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)為總細(xì)胞，計(jì)算腫瘤細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比。(2)CD34：先用低倍鏡(×40)找出腫瘤微血管密集區(qū)，然后在高倍鏡(×200)下找出CD34抗原染色陽性的內(nèi)皮細(xì)胞，只要與臨近組織有明顯區(qū)別便計(jì)為1個(gè)血管，每個(gè)標(biāo)本觀察5個(gè)高倍視野并取平均值作為該病例的微血管密度值。(3)MIB-1指數(shù)：對MIB-1免疫組化標(biāo)記切片隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡(×200)視野，計(jì)算腫瘤細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比平均值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，分別將MRS代謝物比值膽堿(Cho)/N-乙酰天冬酰胺(NAA)、NAA/肌酸(Cr)、Cho/Cr與上述3個(gè)病理指標(biāo)進(jìn)行Pearson線性相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 病理情況 結(jié)果(表1)表明：18例患者中，Ⅱ級膠質(zhì)瘤6例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤5例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤7例。共采集89個(gè)病理活檢標(biāo)本，高級別(Ⅲ級及以上)膠質(zhì)瘤都含有2種或以上級別膠質(zhì)瘤成分。

表1 活檢標(biāo)本及患者的病理分級

2.21H-MRS與病理指標(biāo)的相關(guān)性 結(jié)果(表2)表明：Cho/NAA比值與細(xì)胞密度、CD34及MIB-1指數(shù)均正相關(guān)；NAA/Cr比值與細(xì)胞密度、CD34及MIB-1指數(shù)負(fù)相關(guān)；Cho/Cr比值與細(xì)胞密度正相關(guān)，與CD34及MIB-1指數(shù)之間無相關(guān)性。圖1為1例典型病例的1H-MRS及對應(yīng)的病理檢查結(jié)果。

表2 MRS參數(shù)與病理指標(biāo)間的關(guān)系

圖1 1H-MRS及病理檢查典型結(jié)果

患者男性，56歲，病理診斷為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤. A：白色實(shí)線框內(nèi)為感興趣區(qū)，所有體素上標(biāo)有Cho/NAA比值，白色虛線框內(nèi)是穿刺靶點(diǎn)對應(yīng)的5個(gè)體素，由淺入深定義為第1～5號(hào)靶點(diǎn). B，C，D，E，F(xiàn)分別對應(yīng)第1～5號(hào)靶點(diǎn). B：Cho/NAA比值為1.1；C：Cho/NAA比值為2.0；D：靠近腫瘤核心，Cho/NAA比值為3.3，病理顯示腫瘤細(xì)胞重度浸潤；E：Cho/NAA比值為2.0，腫瘤浸潤程度與C基本相似；F：Cho/NAA比值為0.8， 受腫瘤浸潤程度較B輕

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一，我國發(fā)病率為3.13/10萬。該病因侵襲性強(qiáng)、致死率高、易復(fù)發(fā)而引起人們的關(guān)注。目前臨床常規(guī)MRI可以顯示膠質(zhì)瘤形態(tài)學(xué)邊界[3]，但不能提供腫瘤內(nèi)微脈管系統(tǒng)血管生成、代謝物改變或細(xì)胞構(gòu)成等方面的信息。MRS能通過測定腦組織及腫瘤內(nèi)某些代謝物的濃度及比值變化，實(shí)現(xiàn)對病變的定性與定量診斷，從而彌補(bǔ)常規(guī)MRI成像的不足。譜線是MRS主要的表現(xiàn)形式，代謝物的濃度用波譜圖特定頻率范圍內(nèi)的波譜峰下的面積來表示[4]。本研究采用相對定量的方法表示代謝物濃度，采用3個(gè)參數(shù)，即Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr；用于對照的病理學(xué)指標(biāo)為膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度、CD34及MIB-1標(biāo)記指數(shù)。

細(xì)胞密度是指腫瘤細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。McKnight等[5]報(bào)道，Cho/NAA、Cho/Cr與膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度呈正相關(guān)；Croteau等[6]用成層法分析發(fā)現(xiàn)，上述代謝產(chǎn)物與膠質(zhì)瘤級別也有很好的相關(guān)性；Ganslandt等[7]研究顯示，膠質(zhì)瘤中心區(qū)域Cho/NAA比值較瘤周更高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論基本一致。NAA含量多少與神經(jīng)元及軸突數(shù)量有關(guān)；Cho反映了細(xì)胞膜的運(yùn)轉(zhuǎn)功能，細(xì)胞膜前體及膽堿類代謝物的降解產(chǎn)物增加導(dǎo)致Cho升高[8-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr均與細(xì)胞密度之間存在相關(guān)性，其中Cho/NAA、Cho/Cr與細(xì)胞密度正相關(guān)，NAA/Cr與細(xì)胞密度負(fù)相關(guān)。其原因在于：膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速增殖使細(xì)胞膜代謝異常增高，導(dǎo)致Cho增高，而神經(jīng)元的破壞及軸突數(shù)量減少導(dǎo)致NAA下降。McKnight等[5]還認(rèn)為，Cho/NAA是識(shí)別膠質(zhì)瘤變化及膠質(zhì)瘤細(xì)胞浸潤程度的敏感指標(biāo)。本研究顯示，該指標(biāo)與細(xì)胞密度的相關(guān)指數(shù)高于NAA/Cr及Cho/Cr，可能原因在于Cho/NAA比值能反映腫瘤區(qū)的化合物含量的整體變化；隨著腫瘤惡性程度的升高，該比值進(jìn)一步升高[11-12]。

血管生成是膠質(zhì)瘤的一個(gè)重要特征。CD34作為常用的血管內(nèi)皮標(biāo)志物，可以反應(yīng)新生血管的生長代謝狀況。Toyooka等[1]報(bào)道，Cho總含量與腫瘤血管容量有很好的相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，Cho/NAA比值與CD34正相關(guān)，NAA/Cr與CD34負(fù)相關(guān)，與研究[1]結(jié)果相似。然而，本研究顯示，Cho/Cr與CD34無相關(guān)性，原因可能在于本研究基于相對定量，且Cr與腫瘤浸潤程度相關(guān)性差[13]。Cho/Cr雖然不能直接反應(yīng)腫瘤微血管生成情況，但是高Cho濃度往往提示腫瘤細(xì)胞增殖活躍，腫瘤細(xì)胞密集區(qū)局部缺氧刺激血管內(nèi)皮生長因子釋放，導(dǎo)致新生血管密集生成。而腫瘤代謝活躍的區(qū)域同時(shí)伴有神經(jīng)元的破壞，導(dǎo)致NAA下降。因此，推測Cho/Cr及NAA/Cr可以間接反映膠質(zhì)瘤新生血管的生長情況。

Ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原。MIB-1抗體可與Ki-67結(jié)合，用于預(yù)測腦腫瘤級別、生長代謝及預(yù)后。目前，關(guān)于MIB-1指數(shù)與膠質(zhì)瘤MRS參數(shù)及預(yù)后關(guān)系的研究[5-6]較多。Nafe等[14]研究顯示，Cho/NAA與MIB-1指數(shù)不相關(guān)；Tamiya等[8]認(rèn)為，Cho/NAA、Cho/Cr與MIB-1指數(shù)正相關(guān)；Shimizu等[15]研究結(jié)果認(rèn)為，Cho濃度與MIB-1正相關(guān)，而與Cho/NAA、Cho/Cr值的線性相關(guān)性較弱。造成上述研究結(jié)果差異的原因可能在于其多采用單體素，同一膠質(zhì)瘤內(nèi)只留取1個(gè)組織樣本。由于單體素波譜體素范圍過大，容易受腦脊液、壞死成分等影響，壞死成分較多的體素內(nèi)代謝物濃度被稀釋，導(dǎo)致相對定量比值偏倚，從而干擾研究結(jié)果。另外，體素的大小往往大于病理活檢獲取的組織，通過穿刺活檢獲取的組織樣本不能反映整個(gè)體素內(nèi)的組織代謝信息。即使進(jìn)行開顱手術(shù)活檢，由于術(shù)中腦移位，導(dǎo)航下取樣部位也往往不能與MRS采樣體素精確匹配。本研究為避免以上不足，所有病例均采用多體素，術(shù)前利用自主設(shè)計(jì)軟件Biopsy NAV將靶點(diǎn)體素標(biāo)記于導(dǎo)航影像中，并在開顱術(shù)前穿刺獲取組織，以避免腦移位，較以往研究更為精確。本研究發(fā)現(xiàn)，Cho/NAA與MIB-1指數(shù)正相關(guān)，NAA/Cr與MIB-1指數(shù)負(fù)相關(guān)，與研究[8,15]相似；而Cho/Cr在本次研究中與MIB-1指數(shù)沒有相關(guān)性，可能與本研究樣本中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤所占比例偏高，Cr減少較為明顯[16]有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，MRS相對定量參數(shù)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的密度、CD34及MIB-1指數(shù)密切相關(guān)，而以上病理指標(biāo)與腫瘤的惡性程度及浸潤程度正相關(guān)[12-13,16]。這提示可以通過MRS識(shí)別膠質(zhì)瘤及周邊區(qū)域的代謝變化，對膠質(zhì)瘤在術(shù)前進(jìn)行分級、鑒別診斷及評價(jià)療效等，并依據(jù)MRS參數(shù)的變化識(shí)別膠質(zhì)瘤的浸潤范圍，為指導(dǎo)臨床最大安全范圍切除腫瘤提供參考。本研究中連續(xù)選取活檢靶點(diǎn)，這樣的連續(xù)性與膠質(zhì)瘤向周邊浸潤的生物學(xué)行為相一致。病理結(jié)果顯示：高級別膠質(zhì)瘤中均含有2種或2種以上病理級別膠質(zhì)瘤成分，低級別的成分大多位于腫瘤周邊(圖1)。這種分布既說明膠質(zhì)瘤具有異質(zhì)性，也證實(shí)了膠質(zhì)瘤向周邊逐步浸潤生長的特點(diǎn)。此外，MRS參數(shù)的變化說明膠質(zhì)瘤不是等距離浸潤周邊。圖1C和D組織同樣位于近瘤周，但其Cho/NAA比值不同，受腫瘤浸潤的程度也有明顯差異。C和E組織的Cho/NAA比值均為2.0，雖然距腫瘤核心區(qū)域的距離不等，但病理結(jié)果顯示兩者腫瘤浸潤情況基本相似。而圖1B相比于F組織雖然遠(yuǎn)離腫瘤核心區(qū)域，但其Cho/NAA比值大于F，病理顯示B腫瘤浸潤的程度較F更嚴(yán)重。由此可見，膠質(zhì)瘤病理與MRS參數(shù)相一致，這進(jìn)一步證實(shí)了MRS準(zhǔn)確性，說明與傳統(tǒng)MRI影像相比，MRS可能在判斷膠質(zhì)瘤浸潤程度及范圍界定上更加精確。

活檢標(biāo)本和體素之間精確配準(zhǔn)是本研究的另一個(gè)優(yōu)勢。本研究利用自行開發(fā)的標(biāo)記軟件Biopsy NAV，在術(shù)前將穿刺靶點(diǎn)對應(yīng)的體素標(biāo)記在導(dǎo)航序列中，并在開顱手術(shù)前進(jìn)行導(dǎo)航下穿刺獲取組織樣本，避免了目測誤差及腦移位等對穿刺精度的影響。因此獲取的MRS參數(shù)可以更準(zhǔn)確反映活檢標(biāo)本的代謝物改變。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Cho/NAA、NAA/Cr及Cho/Cr和膠質(zhì)瘤細(xì)胞密度、CD34及MIB-1指數(shù)之間存在密切關(guān)系，說明MRS可反映膠質(zhì)瘤的代謝變化，進(jìn)而為臨床提高腫瘤全切除率及制定有效的綜合治療方案提供依據(jù)。