齊惠莉，王烈宏

1. 青海省海西州人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(海西817000)，2.青海省紅十字醫(yī)院婦產(chǎn)科(西寧 810000)

主題詞 盆腔炎性疾病/中醫(yī)藥療法 @活血化瘀方 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 大鼠 血管內(nèi)皮生長因子 免疫因子

盆腔炎性疾病(Pelvic inflammatory disease,PID)是因上生殖道發(fā)生感染而繼發(fā)的一系列炎性病變，常見的有盆腔腹膜炎、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、輸卵管及卵巢膿腫等[1-3]。本病以女性的內(nèi)生殖器、盆腔腹膜及周圍結(jié)締組織等發(fā)生炎性反應(yīng)為主要臨床表現(xiàn)。多由急性盆腔炎而繼發(fā)，在長期炎癥環(huán)境作用下使疾病遷延難愈[4-6]。PID是育齡女性中的一種常見疾病，如未能給予及時(shí)、規(guī)范、有效的治療，可能導(dǎo)致異位妊娠、不孕、盆腔慢性疼痛、炎癥反復(fù)發(fā)作等一系盆腔炎性疾病的后遺癥。中醫(yī)治療本病歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富，具有獨(dú)到優(yōu)勢?；钛龇ǚ媳静〉牟C(jī)與治療原則，為了研究其治療本病的機(jī)理并為臨床用藥積累試驗(yàn)數(shù)據(jù)，本院特開展本次研究?，F(xiàn)將具體研究情況于后文內(nèi)作詳盡闡述。

資料與方法

1 材 料 ①自西安交通大學(xué)動(dòng)物中心購進(jìn)， SPF級(jí)未孕的成年SD雌性大鼠80只，年齡為10～14周，平均(12.16±1.62)周；體重為(180～220) g，平均(203.46±19.78) g；許可證號(hào)為SCXK(陜)2018-003；同時(shí)購買大鼠專用常規(guī)飼料。②造模菌株，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌，均購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心。③藥材，本次治療依據(jù)中醫(yī)活血化瘀法擬定活血化瘀方進(jìn)行治療，方劑組成：當(dāng)歸、桃仁、丹參各20 g，白芍、蘇梗、蒲黃各10 g，香附、枳殼、大黃、牡丹皮、五靈脂各5 g，炙甘草3 g。一劑以500 ml涼水浸泡30 min后，使用中藥房煎藥機(jī)煎至約300 ml藥液備用。均購自同仁堂中藥飲片公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌液制備:將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌三項(xiàng)菌株，分別配制為4.5×109CFU/ml菌液，將三項(xiàng)菌液按2∶1∶1的比例配制為建模感染源菌液。

2.2 分組與建模:將購買的80只大鼠均分為空白對(duì)照組(后簡稱對(duì)照組)、模型組、陽性藥物組(后簡稱陽性組)、觀察組4個(gè)組，每組各20只。對(duì)照組大鼠正常喂養(yǎng)，其他三組大鼠均制備為盆腔炎性疾病動(dòng)物模型。

購進(jìn)后進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，7 d后造模。除對(duì)照組外其余三組共60只大鼠，均以10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，于鼠下腹部的正中處做0.8～1.0 cm的切口，開腹，分離腸管并充分顯露子宮，使用1 ml注射器的針頭對(duì)右側(cè)子宮內(nèi)膜做機(jī)械性劃傷，于劃傷處注入1 ml的感染源菌液，左側(cè)子宮不做機(jī)械劃傷與菌液注射；關(guān)腹。術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)2周，均不給予任何治療。建模2周后，觀察大鼠陰道分泌物增多，飲食量下降，精神萎靡不振為建模成功[7]。

2.3 治療方法:對(duì)照組持續(xù)正常喂養(yǎng)4周。模型組于建模成功后常規(guī)喂養(yǎng)，不予任何治療，持續(xù)4周。陽性組于建模成功后給予1 ml飲用蒸餾水灌胃，每日早晚各1次，持續(xù)4周。觀察組，于建模成功后給予1 ml藥液灌胃，每日早晚各1次，持續(xù)4周。

3 觀察方法 喂養(yǎng)或治療4周為1個(gè)療程，1個(gè)療程后，觀察組取大鼠腹主動(dòng)脈血3 ml，使用離心機(jī)按3000 r/min速度離心后，取得血清，以ELISA法檢測血清中免疫因子：白細(xì)胞介素-10(IL-10)、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-8(IL-8)與炎性因子：單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)的表達(dá)水平。

處死大鼠，摘取雙側(cè)的子宮、輸卵管、卵巢，除去脂肪組織后稱量、記錄置于10%的甲醛固定液當(dāng)中保存。按公式：左側(cè)子宮質(zhì)量-左側(cè)子宮質(zhì)量計(jì)算子宮腫脹度。取固定后的子宮與卵巢組織，經(jīng)脫水、透明處理后制備為石蠟包塊，將包塊制備為4～5μm厚度的石蠟切片，置于載玻片上，于60℃的烤箱內(nèi)過夜；再行脫蠟、水化。以免疫組化法(SABC)檢測VEGF表達(dá)水平；使用Motic 3000型顯微攝影系統(tǒng)400倍下攝片，以Image pro plus 病理圖像處理系統(tǒng)作定量分析，讀取3個(gè)高倍鏡視野內(nèi)的積分光密度(IOD)值，以均值為VEGF的相對(duì)表達(dá)量。染色陽性標(biāo)準(zhǔn)為黃色、黃棕色。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)對(duì)比均使用One-Way ANOVA分析，進(jìn)一步兩兩對(duì)比使用LSD-L分析；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 各組VEGF表達(dá)比較 見表1。各組子宮內(nèi)膜VEGF、卵巢組織VEGF的表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)進(jìn)一步兩兩對(duì)比分析，模型組與陽性組的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組兩兩對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組VEGF表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)比較(ng/ml)

注：與對(duì)照組比較，☆P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與陽性組比較，◇P<0.05

2 各組血清免疫因子比較 見表2。各組間血清免疫因子表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)進(jìn)一步兩兩對(duì)比分析，模型組與陽性組各項(xiàng)免疫因子的表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組兩兩對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組血清免疫因子表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，☆P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與陽性組比較，◇P<0.05

3 各組血清炎性因子比較 見表3。各組間血清炎性因子表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)進(jìn)一步兩兩對(duì)比分析，模型組與陽性組各項(xiàng)炎性因子的表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組兩兩對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組血清炎性因子表達(dá)水平比較(pg/ml)

注：與對(duì)照組比較，☆P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與陽性組比較，◇P<0.05

4 各組子宮腫脹度比較 見表4。各組左側(cè)子宮質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；各組間右側(cè)子宮質(zhì)量、子宮腫脹度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；經(jīng)進(jìn)一步兩兩對(duì)比分析，模型組與陽性組右側(cè)子宮質(zhì)量、子宮腫脹度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，其他各組兩兩對(duì)比右側(cè)子宮質(zhì)量、子宮腫脹度均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表4 各組血清炎性因子表達(dá)水平比較( pg/ml)

注：與對(duì)照組比較，☆P<0.05；與模型組比較，★P<0.05；與陽性組比較，◇P<0.05

討 論

PID是一種女性常見疾病，可累及生殖系統(tǒng)、腹腔、盆腔等諸多器官、組織，病情遷延難愈，復(fù)發(fā)率高[8-10]。PID作為一種感染病原體誘使盆腔組織、生殖系統(tǒng)等炎癥應(yīng)激反應(yīng)，并長期維持炎癥反應(yīng)，并通過淋巴系統(tǒng)、血流系統(tǒng)等逐漸向外浸潤，引起廣泛性炎癥反應(yīng)[11-13]。而病灶局部在長期炎癥反應(yīng)的作用下逐漸形成血流動(dòng)力障礙、組織代謝功能減弱。PID的進(jìn)展與免疫病理損傷及諸多炎性細(xì)胞因子的異常升高表達(dá)相關(guān)。MCP-1為前炎性因子，具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞活性的作用，可促進(jìn)炎性細(xì)胞匯聚從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)、加大炎性反應(yīng)范圍。ICAM-1為免疫球蛋白超家族的重要成員，能夠介導(dǎo)白細(xì)胞及其因子與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，從而導(dǎo)致平滑肌增生，形成組織損傷，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程。TNF-α是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子與炎性促進(jìn)因子，在炎癥的應(yīng)激反應(yīng)過程中起到核心性作用。炎癥反應(yīng)初期時(shí)TNF-α能夠起到免疫調(diào)節(jié)功效，提高機(jī)體的抗感染能力，同時(shí)TNF-α可刺激內(nèi)皮細(xì)胞生成黏附因子，從而誘導(dǎo)炎性介質(zhì)的合成，誘發(fā)子宮形成病理性損傷。白細(xì)胞介素系列是重要的免疫因子，與免疫球蛋白超家族為同一受體，主要由T淋巴細(xì)胞合成，IL-10為免疫調(diào)節(jié)因子，IL-1β、IL-8均為免疫應(yīng)激因子，正常狀態(tài)下IL-10與IL-1β、IL-8形成免疫平衡，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染與炎性反應(yīng)時(shí)，可發(fā)生免疫紊亂或過度免疫，而使免疫平衡被打破，IL-10表達(dá)水下降，IL-1β、IL-8表達(dá)水平上升。炎癥反應(yīng)下組織及血管的通透性升高，使諸多炎癥因子、免疫因子迅速升高入血，從而導(dǎo)致其在血清中的表達(dá)水平發(fā)生異常改變。PID患者的長期炎癥反應(yīng)可刺激VEGF升高表達(dá)，而形成炎癥局部血管、組織等發(fā)生增生、扭曲且彈性張力下降，從而誘發(fā)一系列腫脹、破潰、損傷等病變。因此，血清中的免疫因子、炎性因子與子宮內(nèi)膜、卵巢組織中VEGF的表達(dá)水平能夠客觀的反應(yīng)PID患者的病情程度，亦可對(duì)治療效果的正確評(píng)估提供精準(zhǔn)指導(dǎo)。

本病屬祖國醫(yī)學(xué)的月經(jīng)、帶下病、不孕、淋濁、腹痛、癥瘕積聚等病范疇。多由于脾虛濕聚，肝氣不舒、血滯成瘀，痰濕血瘀互結(jié)，是形成盆腔炎的病理產(chǎn)物?；钛龇榛钛隆⒒鲋痧鰹榛A(chǔ)，兼祛濕清熱是治療盆腔炎的主要大法[14-15]。本院以活血化瘀法為論理基礎(chǔ)，自擬活血化瘀湯治療本病。方中當(dāng)歸性溫，味甘、辛。歸心、肝、脾經(jīng)；有活血補(bǔ)血、調(diào)經(jīng)止痛,潤腸通便作用。桃仁性平，味苦；歸心肝經(jīng)和肺與大腸經(jīng)。桃仁有活血化瘀、祛瘀，潤腸通便作用，多用于瘀血而形成的癥瘕痞塊、便秘等癥。丹參性微寒、味苦，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、養(yǎng)血安神、涼血消癰功效，用于月經(jīng)不調(diào)、心腹瘀血疼痛，積聚、癥瘕，風(fēng)濕熱痹，腫痛瘡瘍，心悸，失眠，煩躁不寧。白芍性微寒，味酸、苦，歸肝脾經(jīng)，有養(yǎng)血柔肝、斂陰止痛，平抑肝陽作用，主要用于月經(jīng)不調(diào)，崩漏，虛汗淋漓，脘腹拘攣急痛，脅肋脹痛。蘇梗性溫，味辛，歸肺、脾經(jīng)，有理氣寬中，行氣化濕、止痛作用，多用于氣郁引起的胸膈痞悶，胃脘脹痛，噯氣泛惡等。蒲黃性平，味甘，歸心包經(jīng)、肝經(jīng)，有活血化瘀，止血，通淋作用，多用于吐、衄血，尿血，崩漏，心腹瘀血作痛，血淋尿道澀痛、產(chǎn)后少腹瘀痛。香附性平，味辛、微甘苦，歸三焦肝經(jīng)；具有疏肝理氣，調(diào)經(jīng)、止痛功效，常用于肝氣不舒的脅肋疼痛，乳房脹痛、月經(jīng)不調(diào)、脘腹、疝氣作脹疼痛。枳殼性微寒，味微辛、酸苦，歸脾胃、肺大腸經(jīng)，有化痰、祛濕消積、理氣寬中作用，由于該藥氣香性散、降中有升，可治療胸膈痞悶，脅肋脹痛，痰滯食積所致脘腹脹滿，瀉痢后重等。大黃性寒，味苦，歸肝、脾、胃、大腸、心包經(jīng)，其功效為瀉下攻積、推陳致新，清熱瀉火,涼血、活血、解毒、祛瘀；現(xiàn)代藥理研究表明：大黃的抗感染、抗氧化作用很強(qiáng)，具有抗炎、解熱調(diào)節(jié)免疫作用，對(duì)于多種病原微生物有很好的抑制、殺滅作用。牡丹皮性微寒，味苦、辛，歸肝、腎經(jīng)、心經(jīng)，具有活血化瘀、清熱涼血、退虛熱、血熱等功效，可用于熱入營血所致的經(jīng)閉痛經(jīng)、血熱發(fā)斑等癥,現(xiàn)代藥理研究顯示牡丹皮有鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗過敏、解熱、抗菌、消炎作用。五靈脂性溫、味甘，入肝經(jīng)，有散瘀止痛、通利血脈，祛瘀止血功效；對(duì)于一切氣滯血瘀疼痛之證均有良好的止痛效果，其止痛之功與乳、沒不分上下。炙甘草補(bǔ)氣和中、調(diào)和諸藥。

本次研究結(jié)果表明，觀察組血清免疫因子表達(dá)水平優(yōu)于模型組與陽性組，但與對(duì)照組仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；提示活血化瘀法可有效改善PID大鼠的免疫應(yīng)激狀態(tài)，但一個(gè)療程的治療仍無法恢復(fù)到正常大鼠水平。觀察組炎性因子優(yōu)于模型組與陽性組，與對(duì)照組亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性，說明活血化瘀方可有效改善PID大鼠的炎癥程度，雖尚未達(dá)到正常大鼠水平，但可通過延長療程提高治療效果。各組大鼠的子宮腫脹度均高于對(duì)照組，但觀察組低于模型組與陽性組，提示活血化瘀法可改善PID大鼠子宮腫脹程度、降低炎癥反應(yīng)。通過對(duì)比各組大鼠子宮與卵巢的VEGF水平可知，活血化瘀法可有效改善PID大鼠子宮與卵巢組織中的VEGF表達(dá)，從而起到控制病情進(jìn)展、抑制炎性反應(yīng)的作用。