王慧 張忠旗 楊小琳 趙金禮

摘 要 目的：開(kāi)發(fā)一種高效率、低成本合成艾塞那肽的方法以滿足規(guī)?；a(chǎn)需要。方法：以N-C延伸策略，將艾塞那肽的39個(gè)氨基酸分成13個(gè)小片段，先用液相法分別合成12個(gè)N端Fmoc保護(hù)小片段肽，用固相法合成第13個(gè)肽樹(shù)脂片段，然后用固相法將12個(gè)小片段依次連接到第13個(gè)肽樹(shù)脂片段上，得到艾塞那肽樹(shù)脂，切割后得到艾塞那肽粗品。最后經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥等過(guò)程，得到艾塞那肽。結(jié)果：合成的艾塞那肽質(zhì)譜表征結(jié)構(gòu)正確，液相色譜顯示純度大于98%。結(jié)論：本方法提高了合成效率，減少雜質(zhì)累積，降低了純化難度，適合規(guī)?；a(chǎn)。

關(guān)鍵詞 艾塞那肽 片段肽 多肽合成

中圖分類(lèi)號(hào)：O629.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2018）11-0084-05

Synthesis of exenatide

WANG Hui*， ZHANG Zhongqi， YANG Xiaolin， ZHAO Jinli（Shaanxi Huikang Bio-Tech Co.， Ltd.， Xian 710054， China）

ABSTRACT Objective： To develop a high efficacy and cost-effective method for the synthesis of exenatide to meet the requirement of a scale production. Methods： Thirty-nine amino acids in exenatide were divided into 13 small protected peptide fragments based on N-C extension strategy， the first to 12th fragments were synthesized by a liquid-phase method， respectively while the 13th fragment was synthesized by a solid-phase method and then the first to 12th fragments were in turn connected into. Fmoc-protective fragment to obtain exenatide resin， which was cleavaged to obtain crude exenatide. Finally， exenatide was obtained by reverse phase HPLC purification and lyophilization. Results： The structure of the synthesized exenatide was verified to be correct by mass spectrometry characterization and its purity was >98% by HPLC. Conclusion： The synthesis efficiency can be improved and the accumulation of impurities and the difficulty of purification can be reduced by this method， which is suitable for the large-scale production of exenatide.

KEy WORDS exenatide； peptide fragments； peptide synthesis

艾塞那肽（exenatide）是一種含有39個(gè)氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為：H2N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-PheThr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-ValArg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH2，也是一種胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類(lèi)似物。研究證實(shí)艾塞那肽具有控制血糖、減輕體重、心血管保護(hù)及抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖等作用。艾塞那肽注射給藥后能夠模擬調(diào)控機(jī)體胰島素的激素在體內(nèi)發(fā)揮作用，具有促進(jìn)胰島素分泌、增加胰島素敏感性及改善胰島細(xì)胞功能的作用[1]，達(dá)到控制血糖的效果[2]。艾塞那肽能通過(guò)減緩胃腸道蠕動(dòng)，使食物吸收減慢，并且作用于大腦餓感中樞從而抑制食欲，減少能量的攝入，從而減輕體重[3]。艾塞那肽還具有心血管保護(hù)作用，能改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、促進(jìn)鈉的排泄、改善缺血損傷的心肌和心功能的恢復(fù)，減少心血管風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素[4]。有研究表明，乳腺癌MCF-7細(xì)胞上存在有選擇性的GLP-1受體，而艾塞那肽有抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的作用[5-6]。

艾塞那肽的制備方法目前主要采用傳統(tǒng)經(jīng)典的固相多肽合成法，如張?jiān)S[1]、于佳一[7]在艾塞那肽藥效評(píng)價(jià)時(shí)所用原料均為用該方法合成，其合成工藝簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，但合成周期較長(zhǎng)，投料量較低，合成效率低、純化成本高，不易規(guī)?；?。利用蘇氨酸，絲氨酸的噁唑衍生物結(jié)構(gòu)上與脯氨酸相似性，此類(lèi)假脯氨酸（pseudoprolines）可以防止多肽聚集，b折疊的形成。張波[8]、竺劍峰等[9]在制備艾塞那肽的固相合成方法中，分別采用Rink Amide MBHA 樹(shù)脂、Fmoc-Rink Amide PEGMatrix樹(shù)脂作為起始樹(shù)脂，采用Fmoc固相合成法逐一偶聯(lián)具有保護(hù)基團(tuán)的氨基酸及類(lèi)脯氨酸假二肽片段合成全保護(hù)艾塞那肽，切割處理后再經(jīng)純化得到該品。該法在合成規(guī)模上大為提高，產(chǎn)物純度也高，但反應(yīng)過(guò)程中采用的原材料成本仍然很高。張騰等[10]將艾塞那肽分為六個(gè)片段進(jìn)行合成，先對(duì)片段進(jìn)行組裝、切割得到Fmoc保護(hù)的艾塞那肽粗品，再進(jìn)行脫保護(hù)和純化得到艾塞那肽純品。此方法結(jié)合了固相法和液相法的優(yōu)點(diǎn)，但投料量較小，僅為0.66 mmol，液相合成片段所含氨基酸序列較長(zhǎng)，合成片段純度較難控制。為滿足規(guī)?；a(chǎn)需要，開(kāi)發(fā)一種高效率低成本合成艾塞那肽的方法成為本領(lǐng)域急需解決的技術(shù)問(wèn)題。

固液相聯(lián)合法合成艾塞那肽克服了傳統(tǒng)經(jīng)典的固相多肽合成法合成長(zhǎng)肽效率低、產(chǎn)品含量低、純化成本高的缺點(diǎn)，提高了合成效率、降低了純化成本、易流程化和規(guī)?；?/p>

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

Fmoc全保護(hù)策略氨基酸及游離氨基酸（吉爾生化（上海）有限公司，HPLC純度≥98%）；Rink Amide-MBHA Resin（天津南開(kāi)和成有限公司）；三氟乙酸、乙腈（美國(guó)Tedia Company， Inc.，色譜純）；其他市售試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為純水或超純水； L2000高效液相色譜儀（日本日立公司）；C18分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.5 mm，大連物理化學(xué)研究所）；LTQ-XL 電噴霧電離質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司）。

1.2 HPLC分析和結(jié)構(gòu)表征

采用液相色譜儀對(duì)合成的艾塞那肽進(jìn)行純度測(cè)定，吸收波長(zhǎng)：215 nm，流動(dòng)相A：0.05%三氟乙酸/水、流動(dòng)相B：0.05%三氟乙酸/乙腈；柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量5 ml；流速 1 ml/min。梯度洗脫程序：B相： 35% 2 min，35%～65% 24 min。

采用質(zhì)譜儀對(duì)合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 片段①合成

1）合成Fmoc-His（Trt）-COOSu 將30.99 g Fmoc-His（Trt）-OH與300 ml 1，4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢?，加?.33 g N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1，4-二氧六環(huán)（按質(zhì)量-體積比為11.35 g∶23 ml）的混合溶液，室溫反應(yīng)3 h，減壓過(guò)濾除去固體不溶物，得到Fmoc-His（Trt）-COOSu的1，4-二氧六環(huán)溶液。

2）合成Fmoc-His（Trt）-Gly-COOH 將4.13 g甘氨酸和4.62 g碳酸氫鈉溶解于蒸餾水中，所得溶液滴加到步驟1）得到的Fmoc-His（Trt）-COOSu的1，4-二氧六環(huán)溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20 h，減壓濃縮，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的檸檬酸水溶液調(diào)節(jié)pH至2～3，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次經(jīng)水洗、飽和食鹽水洗、無(wú)水硫酸鈉干燥、減壓過(guò)濾、減壓濃縮，得到27.07 g Fmoc-His（Trt）-Gly-COOH。

1.5 片段②合成

1）合成Fmoc-Glu（otBu）-COOSu 將21.28 g Fmoc-Glu（otBu）-OH與200 ml 1，4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢?，加?.33 g N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1，4-二氧六環(huán)或者四氫呋喃（按質(zhì)量-體積比為11.35 g∶23 ml）的混合溶液，室溫反應(yīng)3 h，減壓過(guò)濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu（otBu）-COOSu的1，4-二氧六環(huán)溶液。

2）合成Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH 將1.4 步驟2）中的Fmoc-His（Trt）-COOSu替換成Fmoc-Glu（otBu）-COOSu，攪拌反應(yīng)時(shí)間縮短至18 h，其余同法操作，得到22.20 g Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH。

3）合成Fmoc-Glu（otBu）-Gly-Thr-COOSu 將19.30 g Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOH與190 ml 1，4-二氧六環(huán)混合，室溫?cái)嚢瑁尤?.06 g N-羥基丁二酰亞胺，攪拌至溶解，緩慢滴加二環(huán)己基碳二亞胺與1，4-二氧六環(huán)（按質(zhì)量-體積比為9.08 g∶20 ml）的混合溶液，室溫反應(yīng)3 h，減壓過(guò)濾除去固體不溶物，得到Fmoc-Glu（otBu）-Gly-COOSu的1，4-二氧六環(huán)溶液。

1）合成Fmoc-Ser（tBu）-MBHA 樹(shù)脂 將30 g FmocRink Amide MBHA Resin（取代度0.34 mmol/g）用300 ml N，N-二甲基甲酰胺溶脹后，用哌啶與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1∶5的混合液300 ml反應(yīng)20 min脫Fmoc-，分別用異丙醇、N，N-二甲基甲酰胺各300 ml洗滌兩次，加入N，N-二甲基甲酰胺300 ml、7.82 g FmocSer（tBu）-OH、2.76 g 1-羥基苯丙三唑、7.74 g苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5 ml N，N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢? h，得到FmocSer（tBu）-MBHA 樹(shù)脂。

2）合成Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 樹(shù)脂 將Fmoc- Ser（tBu）-MBHA 樹(shù)脂參照1.7步驟1）將7.82 g FmocSer（tBu）-OH替換為6.88 g Fmoc-Pro-OH，其余同法操作，得到Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 樹(shù)脂。

3）合成Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA樹(shù)脂 按照1.7步驟2）的方法向Fmoc-Pro-Ser（tBu）-MBHA 樹(shù)脂上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH，得到Fmoc-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂。Fmoc-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂與所加保護(hù)氨基酸、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、N，N′-二異丙基乙胺的摩爾比為：1∶2∶2∶2∶2。

1.8 艾塞那肽合成

1）組裝連接Fmoc-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-ProSer（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂 將Fmoc-Pro-Pro-ProSer（tBu）-Rink Amide MBHA樹(shù)脂參照1.7步驟1）將7.82 g Fmoc-Ser（tBu）-OH替換為10.43 g Fmoc-Ser（tBu）-Gly-Ala-COOH，其余同法操作，得到Fmoc-Ser（tBu）-GlyAla-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂。

2）組裝連接Fmoc-Arg（pbf）-Leu-Phe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂 按照1.8步驟1）的組裝連接方法，向Fmoc-Ser（tBu）-Gly-AlaPro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂上依次組裝連接Fmoc-Gly-Pro-Ser-COOH、Fmoc-Lys（Boc）-AsnGly-COOH、Fmoc-Glu（otBu）-Trp-Leu-COOH、FmocArg（pbf）-Leu-Phe-Ile-COOH，得到Fmoc-Arg（pbf）-LeuPhe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA樹(shù)脂。

3）組裝連接Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-LeuPhe-Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-SerSer（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA樹(shù)脂 將Fmoc-Arg（pbf）-Leu-Phe-Ile-Glu（otBu）-Trp-LeuLys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-ProPro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂用哌啶與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1∶4的混合液400 ml脫Fmoc-兩次，加入N，N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1∶1∶1的混合液400 ml、12.15 g Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-COOH、2.76 g 1-羥基苯丙三唑、7.74 g苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、3.5 ml N，N′-二異丙基乙胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，常溫?cái)嚢? h，得到Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-Leu-Phe- Ile-Glu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂。

4）組裝連接艾塞那肽 按照1.8步驟3）的方法，向Fmoc-Glu（otBu）-Ala-Val-Arg（pbf）-Leu-Phe-IleGlu（otBu）-Trp-Leu-Lys（Boc）-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser（tBu）-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser（tBu）-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂上依次組裝連接Fmoc-Met-Glu-Glu-COOH、Fmoc-Lys（Boc）-Gln-COOH、Fmoc-Asp（otBu）-Leu-Ser-COOH、Fmoc-PheThr-Ser-COOH、Fmoc-Glu（otBu）-Gly-Thr-COOH、FmocHis（Trt）-Gly-COOH，用哌啶與N，N-二甲基甲酰胺的體積比為1∶4的混合液脫Fmoc-兩次，得到艾塞那肽樹(shù)脂。

所加各片段、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸、 N，N′-二異丙基乙胺與Fmoc-Rink Amide MBHA 樹(shù)脂的摩爾比為：2∶2∶2∶2∶1。

1.9 艾塞那肽成品獲得

用質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三異丙基硅烷5%的切割液，室溫?cái)嚢? h，過(guò)濾，用冷乙醚析出沉淀，得到艾塞那肽粗品，最后經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽14.13 g，收率33.1%（以Rink Amide-MBHA Resin初始投料量10.2mmol計(jì)算，艾塞那肽理論量為42.71g）。

2 結(jié)果

2.1 HPLC分析

采用液相色譜儀對(duì)合成的艾塞那肽進(jìn)行純度測(cè)定，液相色譜圖見(jiàn)圖1，艾塞那肽的純度大于98%，與對(duì)照品保留時(shí)間一致。

2.2 艾塞那肽結(jié)構(gòu)表征

采用質(zhì)譜儀對(duì)合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果見(jiàn)圖2，艾塞那肽分子量4 186.6，從圖2中可以看到[M+2]2+峰2 093.20，與艾塞那肽的分子離子峰一致，證明所合成的艾塞那肽分子量正確。

3 討論

為減少合成的復(fù)雜程度，合成反應(yīng)及溶劑設(shè)計(jì)時(shí)遵循溶劑盡可能簡(jiǎn)單化、統(tǒng)一化的原則。固相組裝合成較長(zhǎng)肽鏈片段的縮合，單一溶劑無(wú)法滿足實(shí)際需要，實(shí)驗(yàn)選擇DMF（N，N-二甲基甲酰胺）-NMP（N-甲基吡咯烷酮）-DMSO（二甲亞砜）=1∶1∶1的混合溶劑作為反應(yīng)溶劑。

氨基酸縮合過(guò)程中常用試劑為：DCM（二氯甲烷）、DMF。DMF由于對(duì)Fmoc全保護(hù)策略氨基酸優(yōu)良的溶解性及其適中的極性，可作為備選溶劑成分。DCM雖然對(duì)樹(shù)脂的溶脹有極大貢獻(xiàn)，但考慮到它的極性太小，反應(yīng)過(guò)程中DCM不利于肽鏈的延伸，因此，DCM不作為混合溶劑成分。NMP具有抑制肽鏈b折疊的作用，能使肽鏈?zhǔn)嬲?，降低肽鏈連接過(guò)程中的困難程度。片段①與片段④、③、②所連接成的片段極性相距較大，對(duì)接過(guò)程溶劑較難選擇，此處將有“萬(wàn)能溶劑”的DMSO作為溶劑成分，有效地解決了這一難題。

片段合成過(guò)程采用二氧六環(huán)作為反應(yīng)溶劑，也可考慮四氫呋喃，此類(lèi)溶劑沸點(diǎn)低，可經(jīng)簡(jiǎn)單處理后回收重復(fù)利用。

因該方法使用了較多游離氨基酸，減少了價(jià)格昂貴的全保護(hù)氨基酸的使用，較傳統(tǒng)固相合成方法具有合成成本低，純度高，周期短等優(yōu)點(diǎn)，是一種經(jīng)濟(jì)的合成艾塞那肽的方法。

本方法對(duì)各片段的純化較為粗放，今后可對(duì)各片段進(jìn)行進(jìn)一步純化，以有助于艾塞那肽收率及純度的提高。同時(shí)，從降低成本考慮，可選用其它廉價(jià)易得的保護(hù)基團(tuán)對(duì)氨基酸進(jìn)行適當(dāng)保護(hù)，或適當(dāng)延長(zhǎng)各片段，采用固相或液相對(duì)接各片段。

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